细胞消化酶的种类、特点及选择依据
细胞消化酶的种类、特点及选择依据
细胞消化酶的重要性
在细胞培养过程中，消化酶起着至关重要的作用。细胞消化酶能够使细胞从组织中分离出来，为后续的实验研究提供纯净的细胞样本。消化酶通过特异性地降解细胞间的连接物质，如蛋白质、胶原蛋白等，使细胞能够从组织中脱离出来，成为单个细胞悬液。
例如，胰蛋白酶是目前应用最为广泛的消化酶之一。它对精氨酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用，可使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样，其活性还与浓度、温度和作用时间有关。在 pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
胶原酶也是常用的细胞消化酶。胶原酶通过水解细胞间质的脯氨酸，从而使细胞离散。它对胶原的消化作用很强，仅对细胞间质有消化作用而对细胞损害不大，适于消化分离纤维性组织、上皮和较硬的癌组织。钙镁离子和血清不会对胶原酶的活性及消化作用产生影响。胶原酶可细分为不同类型，适用范围也各不相同。
此外，透明质酸酶常与胶原酶等联合使用，用于结缔组织的分离；脱氧核糖核酸酶Ⅰ配合胶原酶或透明质酸酶等联合使用，防止DNA导致的细胞凝集；中性蛋白酶与胶原酶等联合使用，分离纤维样组织效率高；弹性蛋白酶与胰蛋白酶和胶原酶等联合使用，用于分离结缔组织和含有大量细胞网状纤维的组织。
综上所述，细胞消化酶在细胞培养中具有不可替代的重要作用，为细胞生物学研究和临床应用提供了关键的技术支持。
常见消化酶种类及特点
（一）胰蛋白酶
胰蛋白酶是一种胰腺丝氨酸蛋白酶，对碱性氨基酸、精氨酸和赖氨酸的羧基参与的肽键具有特异性。它能使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸，主要是动物胰脏合成的胰蛋白酶原前体在肠道中受肠激酶活化而产生，商业用胰蛋白酶多是重组大肠杆菌表达生产的。胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，但对纤维组织和硬癌组织效果差。在组织解离的时候，纯化的胰蛋白酶需要与其它酶如胶原酶联合使用。
（二）胶原酶
胶原酶主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。目前商用胶原酶是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，分为 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 等不同类型，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。胶原酶对胶原的消化作用很强，仅对细胞间质有消化作用而对细胞损害不大，适于消化分离纤维性组织、上皮和较硬的癌组织。钙镁离子和血清不会对胶原酶的活性及消化作用产生影响。
（三）透明质酸酶
透明质酸酶是能使透明质酸产生水解作用酶的总称，广泛分布于自然界中。透明质酸是一种酸性粘多糖，在 ECM 中具有限制水分及其它胞外物质扩散的作用，在各种结缔组织和皮肤中含量丰富。透明质酸酶通过降解透明质酸，常与胶原酶联合用于结缔组织分离。
（四）脱氧核糖核酸酶
脱氧核糖核酸酶Ⅰ是一种可以消化单链或双链 DNA 产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。在细胞分离过程中，它作用于细胞分离降解出的 DNA，防止细胞凝集，一般不单独使用，而是配合胶原酶或透明质酸酶等联合使用。
（五）中性蛋白酶
中性蛋白酶也称分散酶，来源于枯草杆菌，具有比较温和的蛋白水解酶活性，对细胞损伤小且可维持细胞膜完整性。它主要用来从各种不同组织或器官中消化细胞外基质，释放并制备原代单细胞，或用于细胞培养中的细胞收获和接种转移，也被用于防止悬浮细胞培养时的细胞意外结团。常与胶原酶联合使用。
（六）弹性蛋白酶
弹性蛋白酶是猪胰腺来源的一种丝氨酸蛋白酶，催化蛋白和多肽水解，尤其是仅次于中性氨基酸残基的肽键，能水解天然弹力素。它常与胰蛋白酶和胶原酶联合用于结缔组织分离，例如用于解离包含大量细胞间纤维网络的组织，也用于从肺泡中分离 ATII 细胞。
不同细胞对消化酶的选择依据
（一）软组织细胞
如胚胎、上皮、肝、肾等组织细胞，常选用胰蛋白酶或与其他酶联合使用。这是因为胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离这些组织细胞。例如，在分离胚胎细胞时，胰蛋白酶可以作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解，从而使细胞分散开。然而，对于一些较为特殊的软组织细胞，单纯使用胰蛋白酶可能效果不佳，此时可以考虑与其他酶联合使用。比如，与胶原酶合用，可以增加对组织的分离作用。据研究表明，在分离上皮组织细胞时，胰蛋白酶与胶原酶联合使用，能够更有效地分离细胞，提高细胞的纯度和活性。
（二）纤维性组织和癌组织细胞
适合胶原酶，因其对这类细胞损伤小，能有效分离细胞。胶原酶对胶原的消化作用很强，仅对细胞间质有消化作用，对细胞的损害小，因此适于消化分离纤维性组织和较硬的癌组织。不同类型的胶原酶适用范围不同，如胶原酶Ⅰ适用于大多数组织；胶原酶Ⅱ消化能力稍强，通常用于骨、软骨以及较硬 / 致密的肿瘤等致密组织；胶原酶IV相比于胶原酶Ⅰ消化作用稍微温和一些。以分离肝脏肿瘤组织细胞为例，胶原酶Ⅱ能够有效地消化肝脏中的纤维组织和肿瘤细胞间质，使肿瘤细胞与周围组织分离，同时对肿瘤细胞的损伤较小。此外，钙镁离子和血清不会对胶原酶的活性及消化作用产生影响，这使得胶原酶在处理纤维性组织和癌组织细胞时具有很大的优势。
（三）难消化细胞
对于难消化的细胞，需根据具体情况选择含 EDTA 的胰酶或其他组合酶。对于难消化的细胞，如 HCT15、LS411 和 KM12 等，用不含 Ca²⁺和Mg²⁺的 PBS 洗涤一次后，加入稍微多一点含 EDTA 的胰酶，置 37ºC 彻底消化（一般为几分钟）至脱落，然后再加培养基终止胰酶反应、离心。这是因为 EDTA 通过螯合 Ca²⁺，抑制 Integrin 的贴壁活性，作用更加温和。对于一些特别难消化的细胞，还可以考虑使用胰酶/EDTA 联合其他酶的方法。例如，在处理某些纤维性组织中的难消化细胞时，可以将胰酶 / EDTA 与胶原酶联合使用，增强消化效果。实验数据显示，对于特定的难消化细胞，采用合适的组合酶进行消化，能够显著提高细胞的分离效率，减少消化时间，降低对细胞的损伤。
（四）珍贵细胞
对于原代细胞、干细胞等异常珍贵，且难培养的细胞，一般选择较为温和的胰酶类似物，消化更温和细胞毒性更低，且无需胰酶抑制剂进行中和，更加安全；对于像iPSC等难培养细胞，一般选择Accutase这类复合酶，更加特异性进行消化。