综述：植物源外泌体—打破药物递送困局的“绿色奇兵”！
综述：植物源外泌体—打破药物递送困局的“绿色奇兵”！
外泌体作为细胞外纳米囊泡，参与多种生理病理过程和细胞间通讯。过去对哺乳动物源外泌体研究较多，但存在免疫原性、安全性及规模化生产等问题。植物源细胞外囊泡（EVs）因具有易大规模生产、低毒、低免疫原性等优势，在药物递送领域逐渐受到关注。其不仅可作为药物载体，自身含有的蛋白质、miRNAs和次生代谢物等还能与药物协同发挥作用。
湾湾今天分享的是一篇发表在【Drug Delivery and Translational Research】（IF：5.7）上题为“Plant-derived extracellular vesicles: a synergetic combination of a drug delivery system and a source of natural bioactive compounds”的综述文章，该综述旨在为研究和开发基于植物源细胞外囊泡的药物递送系统提供充分的参考。因此，将介绍有关提取方法、表征手段和药物负载的相关内容，同时也会阐述其生物学组成和内含物。最后，展示这些系统作为药理活性物质纳米载体的当前应用情况。
植物源EVs的提取
植物各部分都可作为提取EVs的材料，但不同部位的EVs在粒径、数量和生物活性成分上有差异。常用提取方法包括差速超速离心结合蔗糖梯度纯化（金标准方法，操作简单但耗时、设备昂贵、纯度和产量受限）、超滤（效率高但存在滤膜堵塞等问题）、尺寸排阻色谱法（简单经济但设备特殊、难以规模化）、免疫亲和技术（纯度高但配体少、成本高）、聚合物沉淀（操作简便、成本低但纯度受影响）和微流控技术（快速、灵敏但产量低，更适用于诊断）。
植物源EVs的表征
通过透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）观察其形态；利用动态光散射（DLS）或纳米颗粒跟踪分析（NTA）进行粒径分析，NTA还可测zeta电位以评估稳定性；采用蛋白质免疫印迹法、流式细胞术鉴定膜表面蛋白标记物；运用HPLC结合质谱法、凝胶电泳、ELISA等表征蛋白质含量和分布；通过PCR、微阵列分析和下一代测序技术检测RNA；借助三重四极杆质谱仪进行脂质组学分析。
植物源EVs的生化组成
脂质对囊泡稳定性和保护内容物免受胃消化很重要，不同脂质成分功能各异，如磷脂酸（PA）参与膜的裂变融合、促进外泌体在肠道停留，磷脂酰胆碱影响外泌体从肠道到肝脏的迁移及调节肠道菌群。植物源外泌体不含胆固醇，但含有独特糖脂维持冻干时膜稳定性。非编码RNA（如mRNAs和miRNAs）在细胞间通讯、免疫调节、抗炎和抗癌等方面发挥重要作用，还能调节肠道菌群基因表达。蛋白质主要源于细胞质，不同植物来源的外泌体蛋白质含量和种类有差异，部分表面蛋白参与细胞吸收和物质转移。植物源外泌体还含有多种具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等特性的次生代谢物，可增强药物疗效。
植物源EVs作为药物递送系统
药物负载方法
被动负载法利用疏水分子与脂质双分子层的相互作用，对小分子且具适宜理化特性、尤其是带正电的分子有效。为提高带负电物质的负载效率，研究了多种方法。多次超声处理并间隔冷却后37°C孵育，可提升阿霉素和紫杉醇的内化效率。电穿孔法虽常用于其他纳米囊泡的亲水分子载入，但可能损伤外泌体膜。提取植物源EVs的脂质后再进行载入，可精确控制尺寸和结构，但可能导致天然分子和特性损失。冻融法也可用于载入药物，但多次循环可能影响外泌体膜和细胞摄取效率。
核苷酸负载方法
因核苷酸的大小和负电荷，将其载入外泌体颇具挑战。已有研究尝试多种方法，如将白菜EVs与miRNA在37°C转染6小时，包封效率高且不影响粒径和zeta电位；针叶樱桃外泌体经不同处理载入miRNA，冰浴30分钟未进一步处理的载入效率最高；从姜源EVs提取脂质后与siRNA混合超声、挤出，可制备特定尺寸的模拟EVs，载入siRNA后zeta电位变化小；还有基于聚阳离子物质改变膜表面电荷载入mRNA的方法，比被动孵育效率高。
存储
目前植物源外泌体存储研究有限，多参考哺乳动物外泌体。-70°C以下存储较适宜，可添加海藻糖、二甲基亚砜或甘油等冷冻保护剂防止膜损伤。4°C存储25天，姜源外泌体形态和功能无明显变化。冻干可在较高温度保存，但可能降低蛋白质活性，添加冷冻保护剂可减少脂质双分子层在冰晶形成时的损伤。
植物源EVs负载药物的应用
肿瘤治疗
多项研究表明，多种植物源EVs负载药物在肿瘤治疗中展现潜力。如白菜源EVs负载阿霉素可抑制结肠癌细胞增殖；芹菜源EVs负载阿霉素比脂质体效果更好且毒性低；姜源EVs负载阿霉素并修饰膜后，安全性优于阳离子脂质体；西兰花源EVs负载特定miRNA可降低癌细胞活力；番茄和葡萄柚源EVs负载HSP70蛋白对胶质瘤细胞无毒性且具抗氧化活性；葡萄柚源EVs结合载阿霉素的肝素纳米颗粒可穿透血脑屏障治疗胶质瘤；苦瓜源EVs可增强5-氟尿嘧啶治疗口腔鳞状细胞癌的效果并降低耐药性；柠檬源EVs修饰后负载阿霉素治疗卵巢癌效果良好且生物安全性高。
皮肤病治疗
黄瓜源的植物晶体EVs和经典EVs可作为透皮给药纳米载体，能提高亲脂性活性成分的皮肤渗透效率。
肠道疾病治疗
针叶樱桃源EVs可将miRNA递送至肠道及其他器官，在肠道上皮发挥局部作用。姜源脂质纳米颗粒（模拟EVs）负载6-姜烯酚治疗溃疡性结肠炎，药物释放动力学改善，巨噬细胞摄取增强，生物利用度提高，促进肠道黏膜愈合。
疫苗
橙汁源EVs可作为RNA疫苗递送系统，负载表达SARS-CoV-2病毒蛋白的mRNA，经口服或鼻内给药可触发免疫反应且无毒性。
临床试验
目前多种植物源EVs因天然药理特性处于临床试验阶段，但仅有一项涉及负载活性成分（植物源EVs联合姜黄素治疗结直肠癌）的临床试验，该试验始于2011年，仍在进行中。
总结
植物源EVs作为药物递送系统，相比哺乳动物源外泌体和合成纳米颗粒，具有生物相容性好、安全性高、可规模化生产及含固有治疗成分等优势，在多领域应用前景广阔。然而，植物源EVs存在尺寸和内容物标准化困难的问题，需建立标准化的提取、表征和存储方案。未来研究应聚焦于深入探索其药理和靶向递送特性，创建蛋白质、核酸和次生代谢物相关数据库，明确细胞摄取和生物分布机制，修饰其表面实现精准靶向，以充分发挥治疗潜力，推动创新药物递送系统的发展。