J Cancer | 肺腺癌中 T 细胞耗竭相关基因的鉴定及其免疫治疗作用的预测

J Cancer | 肺腺癌中 T 细胞耗竭相关基因的鉴定及其免疫治疗作用的预测

肺腺癌（LUAD）是肺癌的主要类型之一，其发病率和死亡率在全球范围内持续上升。T细胞耗竭（T cell exhaustion，TEX）是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一，因此研究TEX相关基因对于理解LUAD的发病机制和开发新的免疫治疗方法具有重要意义。本文通过单细胞转录组和批量RNA测序数据，系统地鉴定了LUAD中TEX相关基因，并构建了一个基于9个TEX基因的预后预测模型。研究结果表明，该模型可以有效预测LUAD患者的生存预后，并为免疫治疗提供新的视角。

从单细胞转录组中鉴定TEX相关基因

从Philip Bischoff等人的数据中筛选后，作者使用了六个单细胞数据集和27,066个细胞。通过TSNE分析，共鉴定出18个不同的细胞亚群（附图1A）。作者对这18个细胞亚群进行了注释，并确定了7种细胞类型，包括巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、肥大细胞和B细胞（图1A）。为了量化不同细胞类型中T细胞功能失调的活性，作者使用Seurat软件包中的AddModuleScore函数计算了所有细胞中T细胞功能失调相关基因集的表达水平（图1C）。在这七种细胞类型中，作者观察到内皮细胞、CD8 T细胞和CD4 T细胞中TEX活性显著增加（图1B）。基于TEX活性，作者将细胞分为高TEX组和高低TEX组，并鉴定出两组2063个差异表达基因（DEGs）进行进一步分析（附表3）。热图显示了每个细胞群体的前四个标记基因（图1D）。作者通过计算通信概率（图1E，补充图1B）来研究细胞间的通信网络。此外，作者推断细胞间的通信网络是基于特定的途径和配体受体的。作者发现MHC-II信号通路在CD4T细胞的通信网络中起着关键作用（图1F）。免疫系统主要通过主要组织相容性复合物（MHC）来识别肿瘤细胞的复杂性。肿瘤中MHC-II的高表达对T淋巴细胞抗原呈递至关重要，而CD4+ T淋巴细胞在抗肿瘤免疫中的作用越来越受到重视。

在批量RNA测序转录组中鉴定TEX相关基因

使用ssGSEA分析获得了每个TCGA-LUAD样本的TEX活性评分，这些评分作为后续WGCNA分析的表型数据。通过对TCGA-LUAD数据集进行WGCNA分析，确定与TEX评分显著相关的模块。在排除异常样本后，利用在单细胞测序水平鉴定的2063个差异表达基因（DEGs）构建了共表达网络（图2A）。为确保拓扑网络符合无标度原则，作者选择了最佳的软阈值为4（附图1C）。通过将最小模块基因数定义为60，medissres定义为0.25，作者获得了5个模块（图2B）。作者的研究结果表明，MEbrown模块与bulk-RNA-seq中的TEX评分显著相关（cor = 0.81，图2C）。此外，对于棕色模块，进行了基因重要性（GS）和模块成员关系（MM）的相关性分析，发现存在显著相关性（cor = 0.95，p = 5e-181，图2D）。这意味着棕色模块的基因可能与T细胞耗竭相关的功能显著。此外，火山图（图2E）展示了TCGA-LUAD批量RNA测序数据中肿瘤和正常肺组织之间的差异表达基因（DEGs）（|logFC|> 1和p.d adj < 0.05）。作者从棕色模块中分析的356个基因中，结合批量RNA测序的DEGs，鉴定并选择了66个基因，作者将其命名为T细胞耗竭相关基因（TEXRgenes）（图2F）。作者的分析表明，这些TEXRgenes在批量RNA测序和单细胞转录组水平上都参与了T细胞耗竭（TEX）。这也通过TEXRgenes的GO富集分析得到了确认（附图1D）。

TEX建模和外部验证

为了排除共表达的TEX基因并避免过拟合，作者通过套索回归分析构建了一个由TEX基因组成的预测预后模型。它们是CCL20、CTLA4、KYNU、KRT18、PRKCH、PERP、BTG2、METTL7A和GDF15（图3A、B）。基于这九个与预后相关的TEX基因的加权回归系数，作者开发了一个线性预测模型，计算公式如下：风险评分 = （0.107CCL20+-0.087GDF15+-0.063BTG2+0.069METTL7A+0.144PERP+0.229CTLA4+0.22KRT18+0.162KYNU+-0.059*PRKCH）。为了证明作者模型的稳定性和可靠性，作者将TCGA-LUAD队列作为内部训练集，GSE31210和GSE30219队列作为外部验证队列。根据相同的风险公式，分别计算了TCGA训练队列和GEO验证队列中每个样本的风险评分，作者发现当LUAD患者的风险在两个队列中都升高时，患者表现出缩短的总生存期和增加的死亡率（图3G-I）。根据中位风险评分，作者可以将患者分为两个亚组，HR（高风险）和LR（低风险），以探索HR组和LR组之间的预后差异。Kaplan-Meier曲线显示了两个队列中HR患者和LR患者之间的显著预后差异，LR组患者的生存优势更为明显（图3D-F）。ROC曲线被用作预测患者在1年、3年和5年时间内的生存情况，TCGA-LUAD队列的AUC分别为0.7、0.7和0.69。GSE31210队列的AUC为0.74、0.7和0.75，GSE30219队列的AUC为0.73、0.73和0.66（图3J-L），表明该模型具有良好的预测效果。此外，作者获取了HR组和LR组的临床信息（表1）。

基于TEX模型结合临床特征的柱状线图的创建

风险评分和临床指标被结合起来，开发出预测1年、3年和5年预后生存概率的柱线图（图4A）。随后，校准曲线分析显示患者的1年、3年和5年生存预测曲线与理想的45度校准线非常相似，表明柱状图的稳定性非常好（图4B）。TCGA队列经过时间ROC分析，结果显示柱状图和风险评分的AUC值超过其他指标（图4C）。通过决策曲线分析（DCA），作者发现诊断曲线和风险评分相比其他临床特征具有更好的预测效果（图4D）。为了评估使用TEX构建的生物特征作为预后预测因子的可靠性和临床价值，作者将每个LUAD患者的风险评分与两个标准临床指标进行比较。随后，作者通过连续的单变量和预测分析，采用多变量Cox分析，观察每个因素与患者预后之间的相关性。在分析结果后，显而易见的是，分期、T分期和风险评分（P < 0.001）都是与患者预后在单变量Cox分析中具有统计学显著相关的预测因素（图4E）。然而，在多变量Cox分析后，只有风险评分（P < 0.001）保持显著相关（图4F）。这些发现表明，作者的TEX模型是一种更有效和有影响力的临床决策工具，更适合在临床环境中预测LUAD患者的预后。

TEX在LUAD患者中的临床相关性和生存分析

由于高风险（HR）组和低风险（LR）组的整体生存期（OS）的个体临床特征明显不同，作者根据临床特征将LUAD患者分为五个不同的亚组。这些亚组包括年龄、病理分期（I-II和III-IV）、性别（女性和男性）、病理M分期（M0-1）、N分期（N0-N1）和T分期（T1-2和T3-4）。这种分类旨在实现对这些组之间潜在差异和相似性的更准确、具体的分析。值得注意的是，在所有亚组中，与HR患者相比，LR患者在生存时间方面表现出明显的优势（如图5A-G和补充图2A-H所示）。作者对结果的分析使作者得出结论，TEX模型是一个可靠的临床预测工具。

基因集富集分析

GSEA被用于识别在两个TEXRS组中富集的KEGG基因集。GSEA图显示了前5个通路。低TEXRS组的基因集富集了与免疫相关的通路，如T细胞受体信号通路、肠道免疫网络产生IGA等，而高TEXRS组的基因集富集了与细胞周期和癌症相关的通路（图6A、B）。GSVA分析了两组之间差异富集的HALLMARK通路（图6C）。结果显示，高风险组主要富集了致癌通路，而低风险组主要富集了与免疫相关的通路。高风险组和低风险组的差异分析显示，差异基因主要富集在细胞周期、p53信号通路等（图6D）。这些发现得到了TEXRS和标志物通路得分之间的相关性分析的进一步支持（图6E），表明TEXRS与与癌症相关的生物过程和代谢通路密切相关。

与低风险组和高风险组相关的TEXRS基因突变

肿瘤内部的异质性（ITH）是由于突变积累导致癌症的一种众所周知的基因组特征。已经证明ITH与恶性肿瘤和对化疗的抗性增加有关。在本研究中，作者使用突变等位基因肿瘤异质性（MATH）算法测量了LUAD患者的ITH；较高的MATH分数与较高的ITH相关。LUAD患者的高风险组的MATH分数较高。作者进一步探讨了ITH与LUAD患者风险评分之间的关系，在本研究中进行了Spearman相关分析，发现风险评分与MATH分数之间存在显著正相关，表明这两个指标的结合可以更好地评估LUAD患者的预后。此外，HR组和LR组的TMB分析显示两者之间存在显著差异，HR组的TMB较高。风险评分与TMB之间也存在显著正相关。众所周知，遗传突变是肿瘤发生的条件。在TCGA数据库中，作者基于TEX签名与HR和LR组合，对体细胞突变数据进行了可视化和相关性分析。在HR组中，突变频率最高的三个基因分别是TP53（56%）、TTN（51%）和MUC16（44%）（图7E、F）。

TEX风险评分预测肿瘤微环境和免疫细胞浸润

已经确定，癌细胞与肿瘤微环境之间的相互作用对于肿瘤的进展和扩散至关重要 36 。因此，在本研究中，为了评估LUAD样本的免疫浸润状态，作者使用ESTIMATE算法计算了TEXRS风险亚组的免疫得分、基质得分和ESTIMATE得分。免疫得分、基质得分和ESTIMATE得分在低风险组中显著较高（图8A）。接下来，作者使用CIBERSORT结果通过Spearman相关分析筛选与TEXRS显著相关的免疫细胞类型（图8B）。为了进一步分析高风险组和低风险组之间特定免疫细胞浸润的差异，作者使用CIBERSORT算法量化了每个样本中免疫细胞浸润的丰度，结果显示T细胞和巨噬细胞的比例较大（图8C）。通过应用ssGSEA算法进行验证，得到了类似的结果（图8D）。先前的研究已经报告了免疫检查点的高表达与免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的更好反应相关 37 - 39 。因此，作者在风险评分的基础上分析了免疫检查点的差异，并发现低风险组的表达较高（图 （图8E）） 40 ，作者还比较了不同组之间HLA的分子差异（图 （图8F））。此外，作者发现TEXRS中的九个基因与肿瘤浸润免疫细胞高度相关，其中CTLA4和KYNU与T细胞CD8呈正相关，METTL7A与M2巨噬细胞呈正相关（图 （图8G））。TIDE结果表明高风险组的得分较高，这可能意味着高风险组可能具有更强的免疫逃逸（图 （图8H））。

预测和验证免疫疗法的疗效

为了进一步验证我们的结果，作者分析了从 TCIA 数据库获得的 IPS 分数。较高的 IPS 分数预测了对 ICI 疗法的更好反应，包括 PD-1 抑制剂和 CTLA4 抑制剂疗法，并被分为四个类别：ips_ctla4_pos_pd1_pos，ips_ctla4_pos_pd1_neg，ips_ctla4_neg_pd1_pos 和 ips_ctla4_neg_pd1_neg。作者的结果显示，所有四个类别在低风险组中显著升高，表明低风险组的患者对抗 CTLA4 疗法以及抗 pd-1 和抗 CTLA4 疗法的联合治疗的反应优于高风险组的患者（图 9A-D）。除了在真实的免疫治疗队列中测试风险评分在预测免疫治疗潜力方面的能力外，作者选择了接受免疫治疗的四组患者（IMvigor210、GSE78220、GSE35640 和 GSE100797），结果显示低风险组中完全缓解/部分缓解（完全反应/部分反应，CR/PR）比例显著较高，并且对免疫治疗的反应者数量也较高，相比之下高风险组中的情况较低（图 9F、G、J、K、M、N、O、P）。同样，在所有四个队列中，低风险患者可能有更好的预后（图 9E、H、I、L）。所有这些结果表明低风险组具有良好的免疫治疗效果。

TEX 中关键调控基因的鉴定

为了确定 TEX 风险亚组中的关键调控因子，首先作者验证了这九个基因的 mRNA 表达水平，并发现 CCL20、CTLA4、GDF15、KRT18 和 PERP 在肿瘤中高度表达，而 KYNU、METTL7A、PRKCH 和 BTG2 在正常组织中高度表达（图 10A）。此外，作者使用 ROC 诊断曲线筛选关键调控因子，发现只有 KRT18、METTL7A 和 PRKCH 的 ROC>0.85，因此我们得出结论，这三个基因是 TEXRS 的关键调控基因（图 10B-D，补充图 3A-F）。作者还绘制了 KM 曲线来验证这些基因的生存情况（补充图 4A-I）。这些结果表明，KRT18、METTL7A 和 PRKCH 是 TEXRS 的关键调控基因。最后，作者评估了这三个核心基因在 TEXRS 中的表达情况，包括一个正常细胞系（2B）和两个肺腺癌细胞系（A549 和 H1299）（图 10E-G）。结果显示，METTL7A 和 PRKCH 的表达在正常细胞系中显著上调，而 KRT18 的表达在肿瘤细胞系中显著上调。

总结

TEX 模型显示出良好的预测性能，并为评估预免疫疗法的疗效提供了新的视角，为未来肺腺癌治疗提供了新的策略。

原文来自360doc