HPLC同时测定桂附地黄丸(浓缩丸)中4种活性成分的含量

HPLC同时测定桂附地黄丸(浓缩丸)中4种活性成分的含量

桂附地黄丸是一种常用的中成药，由熟地黄、附子、肉桂等八味中药组成，具有补肾阳、温经脉等功效。为了更好地控制该药品的质量，本文采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定其中四种主要活性成分（马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚）的含量，建立了科学、准确的质量控制方法。

桂附地黄丸（浓缩丸）由熟地黄、附子（制）、肉桂、山茱萸（制）、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓8味中药材组成，用于肾阳不足，腰膝酸冷,肢体浮肿，小便不利或反多，痰饮喘咳，消渴[1]。方中山茱萸具补益肝肾、涩精固脱的功效，马钱苷为其主要活性成分之一[2-3]；肉桂具有补火助阳、散热止痛、温通经脉的功效，主要活性成分为挥发油中的桂皮醛[4-5]；牡丹皮有清热凉血、活血化瘀的功效，主要活性成分为芍药苷和丹皮酚[6]。本研究采用高效液相色谱法同时测定桂附地黄丸（浓缩丸）中马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚的含量，能够比较全面的控制桂附地黄丸（浓缩丸）的内在质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦）；XS105 DualRange型十万分之一天平（METTLER TOLEDO）；FRQ-1006HT型超声波清洗器（杭州法兰特）。

1.2 药品与试剂

甲醇、乙腈、磷酸（色谱纯 科密欧公司）；超纯水；马钱苷（中国食品药品检定研究院，批号：111640-201005）；桂皮醛（中国食品药品检定研究院，批号：110710-201720）；芍药苷（中国食品药品检定研究院，批号：110736-201842）；丹皮酚（中国食品药品检定研究院，批号：110708-201407）；桂附地黄丸（浓缩丸）（市售，批号180301,180401,180403）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备
精密称取马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚各适量，加甲醇制成每1 mL含马钱苷0.2089 mg、桂皮醛0.2006mg、芍药苷0.2082mg、丹皮酚0.3026mg的贮备液，再取贮备液适量，加甲醇制成每1 mL含马钱苷20.89 μg、桂皮醛20.06 μg、芍药苷20.82 μg、丹皮酚30.26 μg的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备
取本品适量，研细，取约2.0 g，精密称取，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min（功率500 W，频率25 kHz），取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性溶液的制备
按工艺方法制备缺山茱萸、肉桂和牡丹皮的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A，0.3%磷酸为流动性B，梯度洗脱（0～20 min，11%A；20～35 min,11%→18%A；35～45 min，18%A；45～46 min，18%→40%A；46～60 min40%A）；流速1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积10 μL；检测波长为240 nm。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性与系统适用性实验
取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液，依“2.2”项下色谱条件进样分析，结果见图1。马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚与其它峰分离较好，供试品与对照品色谱相应的位置上，马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚色谱峰保留时间一致；而阴性样品溶液在此保留时间无相应的色谱峰出现，表明没有其它成分干扰。目标峰与相邻色谱峰分离度均>1.5，理论塔板数均不低于5000，方法适用性良好。

A：混合对照品溶液；B：供试品溶液；C：阴性样品溶液；1：马钱苷；2：芍药苷；3：桂皮醛；4：丹皮酚

图1 混合对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液的高效液相色谱图

2.3.2 线性关系考察
分别精密吸取“2.1.1”项下的对照品贮备液0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。在“2.2”项色谱条件下进行测定，以峰面积值为纵坐标（y），浓度（μg·mL-1）为横坐标（x）绘制标准曲线，并进行回归，结果见表1。各成分在相应范围内均呈良好的线性关系。

表1 回归方程及线性范围

2.3.3 精密度实验
在“2.2”项色谱条件下，精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚的RSD分别为0.15 %、0.33 %、0.09 %、0.62 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性实验
取同一批供试品（180301）6份，按“2.1.2”项下方法处理，按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱图并计算含量，马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚的RSD分别为0.60 %、0.51 %、0.37 %、0.22 %（n=6），表明方法有较好的重复性。

2.3.5 稳定性实验
取同一份供试品溶液，分别在0，4，8，12，24，48 h时，按“2.2”项下色谱条件进行测定，测得供试品中马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.13 %、0.71 %、0.21 %、0.62 %（n=6），表明供试品溶液在48小时内稳定。

2.3.6 回收率实验
取已知含量的供试品（马钱苷0.6032 mg·g-1，桂皮醛0.1084 mg·g-1，芍药苷0.8626 mg·g-1，丹皮酚1.8930 mg·g-1）6份，每份约1.0g，精密加入等量的马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚对照品，分别制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，计算回收率。马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚的回收率分别为99.60 %、96.96 %、99.32 %、98.86%；RSD分别为0.72 %、1.51 %、0.55 %、1.47 %。

2.4 含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下方法处理，按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱峰峰面积，计算四种活性成分的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

本研究考察了加热回流和超声提取两种方法，提取结果无显着差异，最终选用简单省时的超声提取方法。采用DAD全波长扫描发现马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚的最大吸收波长分别为240 nm、290 nm、230 nm、274 nm，为了方便测定同时保证检测灵敏度，最终选择240nm作为最佳测定波长。根据4种活性物质的性质，在流动相比例选择中，参照《中国药典》2015年版一部[7]考察了乙腈-磷酸、甲醇-磷酸等多种比例的流动相，发现以乙腈和0.3 %磷酸为流动相，采用梯度洗脱，供试品和对照品溶液的色谱峰分离效果最好。

本研究通过高效液相色谱法同时测定马钱苷、桂皮醛、芍药苷和丹皮酚四种成分的含量，节约了实验成本和时间。该方法专属性、稳定性较好，准确度高且方便快捷，能较好的反映桂附地黄丸（浓缩丸）的质量状况，为该药品的质量控制提供参考依据。