贵州医科大学郭兵团队揭示自噬与肥胖研究新进展

贵州医科大学郭兵团队揭示自噬与肥胖研究新进展

肥胖是由于能量摄取过多导致脂肪组织块的异常堆积而引起的，它能增加2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和其他心血管疾病的发病率，因而对人类健康的产生了巨大威胁。因此，治疗肥胖症的药物研发一直是医学研究的热点和重点。但是，由于其病因复杂，导致肥胖症的病理机制尚未完全阐明，深入揭示肥胖症的病理新机制和新靶点对于代谢性疾病的防治具有重要意义。

自噬（Autophagy）是一种对细胞稳态至关重要的自我降解过程，在脂肪组织的脂质代谢中发挥着重要作用，可以通过脂质动员来维持能量平衡，进而改善肥胖。TIGAR(Trp53诱导的糖酵解调节磷酸酶）已被确认为糖酵解调节因子，它能将糖酵解途径转变为戊糖磷酸旁路，产生大量的NADPH和核糖。目前关于TIGAR在脂质代谢上的作用仍有待确定。

2024年4月30日，贵州医科大学、贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室郭兵教授团队在细胞生物学相关领域Top期刊Autophagy（最新IF=13.3）上在线发表题目为“TIGAR exacerbates obesity by triggering LRRK2-mediated defects in macroautophagy and chaperone-mediated autophagy in adipocytes”的研究论文，该研究揭示了TIGAR通过LRRK2-RAB7B复合体抑制自噬加重肥胖的病理新机制，为治疗肥胖提供了一种新的可能。

研究结果

01

TIGAR+/+小鼠表现出脂肪量和脂肪细胞大小的增加

为了探究哺乳动物TIGAR在体内的功能，研究人员对TIGAR全身过表达(TIGAR+/+)小鼠的表型进行分析。正常饲料喂养12个月后， TIGAR+/+小鼠与野生型(WT)鼠相比，观察到（不论雌雄）TIGAR+/+小鼠的体重更大，附睾WAT (eWAT)、 腹股沟WAT (iWAT)和皮下WAT(sWAT)质量显著增加，但棕色脂肪组织 (BAT)重量未见明显变化。此外，通过组织学检测和油红染色发现TIGAR+/+小鼠eWAT的脂肪细胞大小、死亡脂肪细胞和巨噬细胞浸润均升高。以上发现表明TIGAR可能参与脂肪组织的代谢过程（图1）。

图1 TIGAR+/+小鼠表现出脂肪量增加和脂肪细胞增大

02

TIGAR+/+小鼠表现出肥胖表型和代谢紊乱

接着该团队探究了TIGAR在全身能量代谢稳态的作用。通过小鼠摄食量、耗氧量、CO2产量、能量消耗(EE) 、呼吸交换比(RER)等指标的检测发现TIGAR+/+小鼠对脂肪酸氧化的利用存在阻碍，这些结果与血清脂质谱一致。然后研究人员通过非靶脂质组学检测发现TIGAR+/+小鼠白色脂肪组织中脂质组分明显失调。综上，TIGAR可能会破坏脂质和葡萄糖的代谢稳态（图2）。

图2 TIGAR+/+小鼠有肥胖表型的趋势

03

TIGAR促进脂肪细胞分化

基于以上结果，研究人员认为TIGAR可能参与脂肪细胞分化的过程。3T3-L1是前脂肪细胞，可诱导分化为成熟的白色脂肪细胞。在3T3-L1细胞的脂肪形成过程中，观察到TIGAR蛋白上调，特别是在脂肪细胞分化的后期。为了进一步评估TIGAR在脂肪细胞中的作用，该团队从WT和TIGAR+/+小鼠的脂肪组织中分离了基质血管细胞(SVF)和成熟脂肪细胞，发现TIGAR在成熟脂肪细胞中表达丰富。为了研究TIGAR在脂肪形成中的作用，研究者过表达TIGAR全长cDNA (TIGAR OE)构建了TIGAR OE 的3T3-L1细胞系。发现TIGAR在3T3-L1前脂肪细胞中的过表达会导致脂质积累增加。因此，TIGAR可能是促进脂肪生成的一个新因素（图3）。

图3 TIGAR在脂肪细胞分化过程中的动态调节

04

TIGAR+/+小鼠脂肪组织中Lrrk2和Rab7b基因水平升高

为了进一步明确其中的分子机制，研究人员对WT和TIGAR+/+小鼠的脂肪组织进行了定量转录组测序以及ChIP-X富集分析3 (ChEA3)工具表达谱检测，发现在TIGAR+/+鼠白色脂肪组织中Lrrk2和Rab7b基因水平明显上调。为了更深入地了解WT和TIGAR+/+小鼠脂肪组织中mRNA谱差异的潜在生物学机制，研究人员进行了生物信息学分析。以上结果一致认为Lrrk2和Rab7b蛋白可能是导致TIGAR+/+小鼠脂肪组织脂质代谢失调的主要原因(图4)。

图4 TIGAR+/+小鼠脂肪组织中Lrrk2和Rab7b基因表达上调

05

TIGAR通过巨自噬缺陷加重脂肪细胞的脂质代谢功能障碍

由于WT和TIGAR+/+小鼠脂肪组织mRNA谱的GO和KEGG分析表明，变化的基因主要与巨自噬的调节有关，因此，该团队评价了TIGAR调控巨自噬的功能。Western blot结果表明巨自噬过程受动态调控，并且在脂肪细胞分化过程中起重要作用。接着该团队检测了过表达TIGAR(TIGAR OE)的3T3-L1脂肪细胞及其对照细胞(Mock)的自噬水平，并且转染mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒，并通过mRFP-LC3和GFP-LC3点的共定位来评估自噬通量。免疫荧光和油红染色等实验结果表明TIGAR通过巨自噬缺陷来加剧脂肪细胞中的脂质积累。此外，研究人员对3T3-L1细胞系通过shRNA进行Tigar敲低，然后在TIGAR敲低的脂肪细胞中评估p62转换试验。结果表明，抑制TIGAR可导致LC3-II和BECN1水平显著升高。使用自噬抑制剂3-MA处理可部分消除TIGAR敲低诱导的巨自噬激活。综上所述，TIGAR抑制巨自噬，导致脂肪细胞脂质代谢功能障碍(图5)。

图5 TIGAR的过表达通过抑制巨噬而加重脂肪细胞的脂质积累

06

TIGAR介导LRRK2抑制脂肪细胞的脂质动员和自噬通量

为了进一步研究TIGAR在脂质代谢中的作用，研究人员从完全分化的脂肪细胞中提取LDs部分，在提取的LD中检测到了LC3-II的富集，TIGAR敲低后增加了LC3-II在LD中的定位。然后为了研究TIGAR对LDs向溶酶体运输的影响，该团队在scramble和TIGAR KD细胞中通过免疫染色评估了自噬小体标志物LC3-II，并且用mRFP-GFP-LC3感染了TIGAR KD和scramble细胞系。发现在TIGAR KD细胞中观察到更少的LDs和更多的LC3-II斑点和LD共定位，此外，LRRK2的过表达抑制了TIGAR敲低对自噬通量和自噬小体形成的激活。综上，这些结果表明TIGAR通过LRRK2抑制脂质自噬（图6）。

图6 TIGAR通过LRRK2阻断脂质动员和自噬通量

07

TIGAR通过调节LRRK2抑制脂肪细胞中的CMA

脂质吞噬引发脂质动员取决于分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)。因此，该团队使用表达KFERQ-PS-CFP2的光转换荧光报告基因追踪CMA，并且利用了GAPDH- HaloTag (HT)进一步探究CMA活性，该系统可以监测GAPDH从细胞质到溶酶体的易位。此外，通过免疫印迹法发现在TIGAR KD脂肪细胞中，分离的LDs中检测到LAMP2A和HSPA8的表达富集。为了验证TIGAR敲低通过激活CMA来减弱脂质积累，研究人员在脂肪细胞中敲低了LAMP2A，发现抑制LAMP2A逆转了TIGAR敲低诱导的TG和T-CHO含量降低和脂质积累。综上所述，这些发现表明TIGAR通过CMA改善脂肪细胞脂质积累（图7）。

图7 TIGAR通过LRRK2抑制CMA

08

TIGAR驱动LRRK2-RAB7B复合物的形成，促进脂质积累

由于TIGAR+/+小鼠脂肪组织中LRRK2和RAB7B的显著上调，所以当敲低LRRK2时，TIGAR OE脂肪细胞中的RAB7B蛋白明显高于对照细胞， RAB7B GTPase抑制剂ML282逆转了这一现象，表明LRRK2与RAB7B之间存在物理相互作用。内源性LRRK2和RAB7B在3T3-L1脂肪细胞和原代SVF细胞中的共定位也证实了这种相互作用。为了进一步证明TIGAR驱动LRRK2与RAB7B相互作用以阻断LDs的溶酶体降解，我们确定了溶酶体和LDs的共定位。发现TIGAR过表达导致LDs的积累，而ML282阻断了这种作用。综上表明TIGAR驱动LRRK2与RAB7B相互作用，抑制LDs溶酶体降解(图8)。

图8 TIGAR驱动LRRK2与RAB7B相互作用抑制LD溶酶体降解

09

TIGAR抑制LRRK2多泛素化依赖性降解

为了明确脂肪细胞中TIGAR和LRRK2之间的关系，我们推测TIGAR调节了LRRK2的多泛素化依赖性降解。我们发现LRRK2的表达与TIGAR在体外的表达呈正相关。为了进一步探讨TIGAR是否参与LRRK2的泛素化降解，我们分析了环己亚胺追踪法。蛋白酶体抑制剂MG132增强了TIGAR过表达对3T3-L1脂肪细胞和原代SVF细胞中LRRK2蛋白升高的影响。发现TIGAR敲低后促进了LRRK2蛋白的多泛素化，这表明TIGAR介导LRRK2的蛋白酶体降解。此外，E3泛素连接酶STUB1在TIGAR OE细胞和TIGAR+/+小鼠的原代SVF细胞中明显降低，并在脂肪细胞分化过程中逐渐下调。蛋白酶体抑制剂MG132可逆转TIGAR KD诱导的LRRK2的降低，而溶酶体抑制剂氯喹CQ或自噬抑制剂3-MA则不能逆转，这表明TIGAR通过泛素-蛋白酶体途径降解LRRK2。此外，3-MA和MG132共同给药诱导TIGAR KD脂肪细胞中更明显的脂质积聚。以上结果提示TIGAR通过E3泛素连接酶STUB1上调LRRK2的表达，进而加剧脂肪细胞的脂质积累（图9）。

图9 TIGAR抑制LRRK2多泛素化依赖性降解

10

脂肪特异性TIGAR缺失和脂肪组织靶向纳米乳剂DNL201减轻TIGAR+/+小鼠的肥胖表型

为了进一步阐明TIGAR在肥胖中的具体作用，研究者在WT和TIGAR+/+小鼠中，通过注射携带TIGAR shRNA和脂肪细胞特异性启动子Adipoq (AAV-Adipoq-TIGAR-shRNA)以及对照（AAV- scram），建立了白色脂肪组织特异性TIGAR缺失模型。AAV-Adipoq-Tigar-shRNA靶向递送在WAT中实现了组织特异性Tigar敲低，结果发现与AAV-Scram相比，TIGAR+/+小鼠WAT中脂肪特异性Tigar基因敲低可减轻肥胖症状。值得注意的是，与AAV-Scram组相比，Tigar+/+小鼠的脂肪特异性Tigar敲低后表现出自噬增强，其特征是iWAT中BECN1蛋白水平升高，SQSTM1水平降低。最后，探讨TIGAR OE诱导肥胖的作用是否与lrrk2介导的脂肪细胞自噬抑制相关。研究者制备了纳米乳剂，用于将DNL201靶向递送到脂肪组织。发现DNL201-NE处理明显逆转了TIGAR OE导致的自噬抑制（图10）。

图10 DNL201纳米乳剂的脂肪组织靶向性优势减轻了TIGAR+/+小鼠的肥胖表型

总结

该研究发现TIGAR转基因小鼠表现出脂肪量增加并趋向于肥胖表型。非靶脂质代谢组学显示，TIGAR导致代谢谱失调。定量转录组测序发现 TIGAR 小鼠脂肪组织中 LRRK2 和 RAB7B 水平升高。体外证实，TIGAR过表达通过抑制多泛素化降解来增加LRRK2的水平，从而抑制巨自噬和伴侣介导的自噬（CMA），同时增加脂质积累，而脂质积累被LRRK2抑制剂DNL201逆转。此外，TIGAR驱动LRRK2与RAB7B相互作用以抑制脂滴的溶酶体降解，而脂肪细胞中增加的脂滴则被RAB7B抑制剂ML282阻断。此外，TIGAR小鼠的脂肪特异性TIGAR敲除缓解了肥胖症状，脂肪组织靶向纳米乳剂DNL201减轻了TIGAR小鼠的肥胖表型。综上所述，本研究结果表明，TIGAR通过LRRK2介导的脂肪细胞巨自噬和CMA抑制，在脂质代谢中发挥了至关重要的作用。

研究结果表明，TIGAR有可能成为治疗肥胖及其相关代谢功能障碍的可行治疗靶点。