知识梳理| 一文讲透ADCC及蛋白修饰方法
知识梳理| 一文讲透ADCC及蛋白修饰方法
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是一种重要的免疫防御机制，它通过动员免疫系统的效应细胞来清除标记有特定抗体的异常或病变细胞。本文将对ADCC的基本原理、作用机制以及在抗体药物开发中的应用进行全面总结。
什么是ADCC？
ADCC（Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity）是指当特定抗体与靶细胞表面的抗原结合后，抗体的Fc区域能够与免疫效应细胞（主要是NK细胞，但也包括巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞）表面的Fcγ受体结合，激活这些效应细胞，进而引发细胞毒性反应，最终导致靶细胞的破裂和死亡。
图片来源于Sigma官网
在介导ADCC过程中，最关键的Fc受体是FcγRIIIa（也称为CD16a），主要表达在自然杀伤（NK）细胞上。FcγRIIIa能够与抗体（通常是IgG）的Fc区域结合，从而触发NK细胞释放细胞毒性分子，比如穿孔素（perforin）和格朗齐酶（granzymes）的颗粒。穿孔素在靶细胞膜上形成孔洞，使格朗齐酶能够进入靶细胞内部，从而触发细胞凋亡。同时，效应细胞还会释放多种细胞因子（干扰素-γ（IFN-γ），增强靶细胞的抗原呈递和免疫细胞的活性；肿瘤坏死因子-α（TNF-α），直接对靶细胞具有毒性作用，并促进炎症反应；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），有助于激活和增殖其他免疫细胞；其他趋化因子，如MIP-1α和RANTES，也参与调控免疫细胞的募集和定位），这些细胞因子能够增强局部的免疫反应，协同杀伤靶细胞。
此外，FcγRI和FcγRIIa也能在一定程度上介导ADCC，通常出现在巨噬细胞和中性粒细胞上，但它们在ADCC中的作用相对次要。
与依赖补体系统的细胞裂解不同，ADCC完全依赖于细胞介导的杀伤，因此具有高度特异性和调控性。
关于ADCC的几个关键问题
1. 如果抗体没有结合靶细胞， Fc 会和FcRs 结合吗？如果这样，不是只要抗体存在就会触发免疫反应？
答：在没有靶细胞的情况下，抗体通常以单体形式存在，其Fc区域分散且不形成聚集状态。只有当抗体与靶细胞表面的抗原结合后，会形成多价的免疫复合物，从而在细胞表面实现Fc区域的密集聚集。这种聚集效应能够显著增强与Fc受体的结合并触发信号传导，进而激活效应细胞。而单个抗体分子由于无法形成足够的交叉联结，其与Fc受体的结合通常是短暂且弱的，不足以引起细胞激活。
以IgG1为例，其Fc区与各类Fc受体和FcRn的亲和力存在明显差异，通常的估计值如下：
- FcγRI (CD64)：亲和力很高，约在10^8 M⁻¹左右，对应的KD大约在10⁻⁸ M量级。
- FcγRII (CD32)：亲和力较低，约在10^6 M⁻¹左右，对应的KD约在10⁻⁶ M左右。
- FcγRIII (CD16)：亲和力一般在10^6到10^7 M⁻¹之间，对应KD可能在10⁻⁶–10⁻⁷ M范围。
- FcRn：与IgG1的结合是pH依赖的。在酸性环境（如pH6.0）下，其亲和力较高，KD约在100-300 nM；而在中性pH（7.4）下，结合非常弱，几乎不发生结合。
2. 聚集效应为什么能够显著增强与Fc受体的结合并触发信号传导？
答：这种聚集效应的结构基础主要在于多价结合（multivalency）的增强作用。单个IgG分子与Fc受体的亲和力较低，但当抗体与靶细胞上的抗原结合形成免疫复合物时，其Fc区域会密集聚集在一起。这种聚集状态允许多个Fc受体同时与复合物上的多个Fc区域结合，从而显著提高整体的结合力（avidity）。这种多点接触和交叉联结不仅增强了Fc受体的结合，还促使受体在细胞膜上聚集和交联，触发下游信号最终激活效应细胞。
3. Fc受体的聚集怎么触发免疫反应SH2结构域的信号分子？
答：具备激活功能的Fc受体，如FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIIa，在交叉联结后会通过ITAM区域磷酸化和随后招募含SH2结构域的信号分子，从而触发免疫反应。而像FcγRIIb这样的抑制性Fc受体则具有ITIM结构域，主要发挥负调控作用，不会通过这种机制激活免疫反应。
- ITAM区域磷酸化：当Fcγ受体因抗体交叉联结而聚集时，其胞内的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）会被Src家族激酶磷酸化。
- SH2结构域信号分子的招募：磷酸化的ITAM区域为含SH2结构域的信号分子（如Syk或ZAP70）提供结合位点，这些分子的结合进一步激活下游信号级联，最终触发效应细胞的免疫反应。
工程化改造方法
在抗体药物开发领域，ADCC是许多抗体发挥治疗效应的重要机制。通过工程化改造抗体的Fc区域，研发人员可以根据不同的治疗需求调控ADCC功能。具体来说：
1. 增强ADCC
通常通过对抗体的Fc区域进行工程化改造来提高其与效应细胞上FcγRIIIa（CD16a）受体的结合亲和力，进而增强NK细胞的杀伤能力。这种策略在抗肿瘤治疗中尤为常见，能够提高抗体对肿瘤细胞的杀伤力。典型的例子包括Obinutuzumab（Gazyva）和Mogamulizumab（Poteligeo）。
去岩藻糖化（Defucosylation）
在N-连接糖基化中，保守的motif通常为N-X-S/T。以人IgG为例，其Fc区域在CH2结构域中有一个关键的N-连接糖基化位点，即第297位的天冬氨酸（N297），这是最为人熟知的糖基化位点。通过减少Fc区糖基中的岩藻糖残基，显著提高抗体与FcγRIIIa的结合亲和力，从而增强ADCC。
2011年Roche在PNAS上发表文章阐述缺乏核心岩藻糖化的抗体与FcγRIIIa的亲和力显著增加，从而提高了受体介导的效应功能（如下图A, SPR 结果）。
图片来源于 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31) 12669-12674, https://doi.org/10.1073/pnas.1108455108 (2011).
N-连接糖基化位点上的碳水化合物链通常由N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和甘露糖组成的复杂型七糖核心构成，随后还可以变异性地添加半乳糖、唾液酸、岩藻糖以及分枝的GlcNAc残基（如上图B）。
图片来源于 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31) 12669-12674, https://doi.org/10.1073/pnas.1108455108(2011).
Roche发现FcγRIIIa在Asn162位点所连接的碳水化合物与无岩藻糖化的Fc区域之间可能形成有效的接触。这些附加的糖链对于免疫球蛋白的功能发挥至关重要。与无岩藻糖化或有岩藻糖化Fc结合的糖基化Fcγ受体的晶体结构，详细阐明了Fc-寡糖核心岩藻糖化在改善ADCC中的调控作用。结构显示，无岩藻糖化的Fc与受体之间形成了一种独特的界面，这一界面依赖于受体和无岩藻糖化Fc糖链之间的碳水化合物–碳水化合物相互作用；而在有岩藻糖化Fc的复合物中，这些相互作用要弱得多或不存在，从而解释了其较低的受体亲和力。
S239D/I332E mutation：增加RcγRIIIa和FcγRIIb的亲和力
S239D/I332E突变首次被报道是在抗体工程领域的一篇具有里程碑意义的论文中，该论文于2006年由Xencor的Lazar等人撰写发表于PNAS。该文作者利用Protein Design Automation (PDA)和Sequence Prediction Algorithm (SPA)等蛋白质工程的方法，通过同源建模对复合物结构分析，将IgG1 Fc区域中的S239替换为天冬氨酸（D）和I332替换为谷氨酸（E），显著增强了抗体与FcγRIIIa的结合亲和力，从而提升了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性。该研究详细描述了这项工作为后续的抗体Fc工程化设计提供了坚实的结构基础和理论依据。
图片来源于Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (11) 4005-4010.
在Fc/FcγR复合物结构的链A上，I332参与了一系列暴露于表面的配位相互作用，而S239与受体的K120发生相互作用（图8B）。在链B上，I332处于类似的配位环境，而S239则处于未成对状态；不过，它们均与受体残基K161的距离在5 Å以内，且S239与受体残基S160的距离在6 Å以内。将S239和I332突变为极性，尤其是带电的极性残基，通常能显著提高FcγRIIIa的亲和力。其中，S239D/I332E变体是这一系列中效果最好的，其可能提供了与受体残基K120、S160和K161之间最优的相互作用网络。
AAA mutation
2001 年，Genetech绘制出人IgG1与人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA以及FcRn受体结合位点的高分辨率图谱。其中，Ser298Ala、Glu333Ala和Lys334Ala突变的组合（AAA突变）对IgG1与FcγRIIIa的亲和力有累加性改善。这种增强的结合力转化为在体外使用Herceptin抗体时，对Her2阳性细胞的杀伤效力提高了50至100倍。
图片来源于 Journal of Biological Chemistry. 2001 Mar 2;276(9):6591-604.
2. 沉默ADCC
在某些情况下，为了减少非特异性免疫活性和相关毒性，抗体的Fc区域会被设计成不与Fcγ受体结合，如通过LALA或N297A等突变，使得抗体在发挥阻断或调节作用时不引起不必要的细胞毒性。这类设计常见于免疫检查点抑制剂，例如Atezolizumab（Tecentriq）和Durvalumab（Imfinzi）。
Asn297Ala/Gly/Gln mutation: 减弱对 FcγRI和 IIIa 和 C1q 亲和力
图片来源于Frontiers in Immunology. 2019 ;10:1296. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01296.
去除IgG Fc区的Asn297糖链会显著降低Fc与Fcγ受体的结合，这是因为这种去糖基化会诱导Fc区呈闭合构象。一些Fc设计通过引入Asn297Gly或Asn297Glu突变来移除297位的N-连接糖基化位点。图中展示了带糖基化的IgG1 Fc（灰色），其N297糖链显示为品红色（PDB: 4BYH）；而在297位引入Gly或Glu残基后，得到无糖基的IgG1 Fc（蓝色和浅紫色；PDB: 3S7G）。将带糖和无糖的Fc晶体结构叠加后可以看出，无糖型Fc的浅紫色和蓝色CH2结构域比带糖型Fc的灰色CH2结构域更为接近。这种CH2构象的改变被认为是解释无糖型Fc降低Fcγ受体结合能力的结构原因。
LALA mutation：减弱RcγRI，II和 III
“LALA突变”指的是在抗体Fc区域中将亮氨酸234和亮氨酸235（Leu234和Leu235）分别替换为丙氨酸（Ala），即L234A/L235A突变。这一突变的主要目的是显著降低抗体与Fcγ受体的结合亲和力，从而沉默抗体的效应功能，特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。
研究表明，将Leu235突变为Glu就足以在U937细胞上完全消除对Fc受体的结合，使与Fcγ受体的结合降低了100倍，从而在存在Leu235Glu突变的IgG1中降低了T细胞激活和增殖。基于这一初步突变，进一步能够消除IgG1和IgG4对FcγRI、IIa和IIIa的可检测结合。与单独使用Leu234Ala或Leu235Ala相比，LALA突变的效果更为显著。在234和235位的单一或双重突变均降低了由外周血单个核细胞（PBMCs）介导的ADCC活性，并几乎完全消除了由单核细胞介导的ADCC。LALA突变已在一期临床试验中得到测试。编码LALA突变的抗CD4抗体OKT3被用于治疗急性肾移植排斥反应，该IgG1携带LALA突变引起的不良反应极少，并在7名患者中成功逆转了6例移植排斥。
LALA-PG Mutation
类似地，在LALA突变中添加Pro329Gly突变，也能抑制IgG2a Fc与小鼠FcγRI、II和III的结合。位置329的氨基酸之所以被改变，是因为该残基与FcγRIIIa的Trp108和Trp131接触。LALA-PG突变相比单独的LALA突变有改进，因为它能够在小鼠和人类IgG中完全消除Fc功能，而单独的LALA突变仍保留小鼠IgG2a与小鼠FcγRIII的结合。LALA-PG突变的重要意义在于，其在小鼠模型中观察到的结果预计能更准确地转化到人类，因为这些突变在小鼠IgG2a和人类IgG1中赋予了相似的表型。
总结
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）作为一种关键的免疫防御机制，在抗体药物治疗中发挥着至关重要的作用。通过精准标记和调动免疫细胞，ADCC能够有效清除异常或病变细胞，并为癌症、感染等多种疾病的治疗提供支持。随着生物工程技术的发展，针对ADCC的调控策略不断优化，为实现更安全、更有效的免疫治疗奠定了坚实的基础。