土壤中筛选微生物原因及取样方法详解

土壤中筛选微生物原因及取样方法详解

在微生物学研究中，土壤是获取微生物资源的重要来源。本文将详细介绍土壤作为微生物生长环境的优势，以及从土壤中筛选和取样微生物的具体步骤和方法。

土壤作为微生物生长环境的优势

微生物的生长发育主要受到营养物、含水量、氧、温度和pH等因子的影响，而土壤恰好满足大部分微生物生长发育的需求：

• 土壤中含有大量的动植物和微生物残体，能够提供微生物作为碳源、氮源和能源的需求。
• 土壤中含有大量且全面的矿质元素。
• 土壤中的水分能够满足微生物对水分的需求。
• 土壤颗粒间的空隙可满足好氧微生物的生长；在通气条件差的情况下，处于厌氧状态时，又可以满足厌氧微生物的生长。
• 土壤的pH范围在3.5至10.0之间，大多数处于5.5至8.5，是大多数微生物的适宜生长的pH范围。
• 土壤温度的变化幅度小而且缓慢，能够适宜微生物的生长。

土壤微生物取样方法步骤

一、准备工作

1. 制定采样计划
   采样前需要确定好实验目的、采样样地、样品数量、采样方法、采样工具、交通、线路以及天气等情况。通常需要准备一份采样报告，详细记录采样的具体情况，例如采样日期、时间，采样点详细位置（GPS定位），天气状况（气温、降水、湿度、云等）等信息。

2. 样地资料收集
   确定采样点后，可以提前收集、了解该地的土壤类型、天气资料、水文资料等信息。实际采样前根据所收集的资料进行现场勘查，最终确定确切的采样点。

3. 采样器具

• 工具类：土钻、铁铲、筛子、镊子、药匙、刷子以及适合特殊采样要求的工具等。
• 器材类：50 mL无菌管、50 mL无菌瓶、美国parafilm封口膜、卷尺、GPS、坡度仪、土壤比色卡、样品箱（具冷藏功能或含干冰）、冰袋、样品袋、一次性手套、口罩、75%酒精、灭菌棉球、无菌水、液氮、干冰等。
• 文具类：样品标签、记号笔、采样记录表等。
• 安全防护用品类：工作服、工作鞋、雨具、安全帽、药品箱等。

注意事项：

• 采样工具和盛放土壤样品的容器必须提前灭菌（锡箔纸包裹，高压蒸汽灭菌后，120℃烘箱过夜），避免外源物质干扰；
• 避免使用吸水、会释放溶剂或增塑剂等物质的器具来盛放土壤样品。

二、土壤取样方案

1. 位置选择
   根据研究目的，进行采样点的选择，采样点的选择应遵循以下原则：

• 采样点土壤类型特征明确，地形相对平坦、稳定，植被良好；
• 坡脚、洼地等具有从属景观特征的地点不宜设置采样点；
• 城镇、住宅、围墙、道路、沟渠、田埂、粪坑、堆肥点、坟墓等地人为干扰大，可能造成土壤特性错乱，使土壤失去代表性，不宜设置采样点；
• 采样点离铁路、公路至少300 m以上；
• 采样点以剖面发育完整、层次较清楚、无侵入体为准，不宜在水土流失严重或者表层土被破坏处设置采样点。
• 不宜在多种土类、多种母质交错分布、面积较小的边缘地区布设采样点。

注意事项：确定采样点后可以使用精准地图或者GPS进行采样点定位，或者在采样点进行标记，便于以后重复取样或者进行比较试验。

2. 取样样方设置
   土壤横向取样方法示意图：
   

3. 土壤取样操作方法

普通土壤（Bulk Soil）样本取样方法

• 移除土壤表面覆盖物，包括植物、苔藓、可见根系、凋落物以及可见的土壤动物等；
• 对采样器使用酒精棉球擦拭，待酒精挥发完全后，可使用采样样方处土壤浸润采样器。后续每次更换样方均需重复此步骤；
• 同一样方采取多点取样（建议4-5个取样点等量均匀混合为一个样本），去除样品中的植物、可见动物以及石粒等，然后根据土壤情况，选择是否过筛：①推荐过2 mm筛；②一些有机质（如粗腐殖质或泥炭等）不能通过2mm筛，此时可以选择过4-5 mm筛；③如果土壤粘度太大或者含水量太高，可以选择不过筛。
• 将混合好的土壤样本，分装多份（3-5份备份样本），每份3-5 g，标记好样本信息后液氮速冻（如果条件不允许，可置于装有冰/干冰的泡沫盒中，黑暗环境下，尽快运回实验室），随后转移至-80℃冰箱保存，用于测定土壤微生物；另外留出一部分土壤，用于测定土壤理化指标（如有机质、全氮、矿质元素等）。

根际土壤（Rhizosphere soil）样本取样方法

作物类（含草地等矮小植物）根际土壤取样方法

• 采集植物植株（多点取样法），去除根部大块土壤，置于装有冰/干冰的泡沫盒中，黑暗环境下，尽快运回实验室；
• 无菌工作台中，晃动植物根部，去除根部松散的土壤后，使用无菌刷子从根部收集残留土壤，或对植物根部使用无菌水（或PBS缓冲液）振荡（详细参数参考引用文献）洗涤植物根系，洗涤液进行12000 g离心10 min以上收集沉淀（或过0.22μm滤膜，收集滤膜）；
• 同一样方多点取样的根际土壤样本等量混合均匀，标记好样本信息后液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。

林木类根际土壤取样方法

• 使用土转采集地面下10-20 cm根际土壤，置于装有冰/干冰的泡沫盒中，黑暗环境下，尽快运回实验室；
• 视情况，选择2-5 mm孔径无菌筛网过筛；
• 同一样方多点取样获得的土壤样本等量混合均匀，标记好样本信息后液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。

（Nature,2013）

4. 样品存储条件

• 避免样品反复冻融，以保证恒定低温效果；
• 注意样品在实验室保存和分析过程中的密封性，以免凝结的水汽或者其他污染源对样品造成污染。

三、样本寄送

• DNA：总量>500 ng，浓度>20 ng/µl，无明显降解，土壤：2 g；
• 单次送样样本量需≥20个，送样管（冻存管）务必标清样品编号，管口使用Parafilm封口膜密封（防止样本间交叉污染），并将填写完整的送样订单用自封袋密封后，随同样品一起使用干冰运输寄送至公司。