干货分享 | 蛋白含量测定——凯氏定氮法

干货分享 | 蛋白含量测定——凯氏定氮法

凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法，广泛应用于食品、饲料、肥料等领域的质量检测。本文详细介绍了凯氏定氮法的原理、实验步骤、所需仪器和试剂，以及具体的计算方法。对于从事相关实验工作的读者来说，这篇文章具有很高的实用价值。

一、原理
　　凯氏定氮法的核心原理是通过化学反应将样品中的有机氮转化为无机氮（硫酸铵），然后通过滴定法测定氮的含量，从而计算出蛋白质的含量。简言之，凯氏定氮法测定蛋白含量需要经过五步，即消解、蒸馏、吸收、滴定、计算：①蛋白样品 + 硫酸（加热/催化剂）→ 硫酸铵；②硫酸铵 + 碱 → 氨气；③氨气 + 硼酸 → 硼酸铵；④硼酸铵 +硫酸/盐酸标准液 →硫酸铵/氯化铵+硼酸；⑤计算酸的消耗量 → 推算氮量/蛋白质量。

二、实验仪器和试剂
1.仪器
消化管或凯氏烧瓶、凯氏定氮仪、消化炉、电子天平、铁架台、锥形瓶、容量瓶、量筒、表面皿、酸式滴定管、移液管、小漏斗、研钵、玻璃珠等。
2.试剂:
（1）消化液：30%过氧化氢、硫酸与水按比例3∶2∶1配制而成，现配现用；
（2）催化剂：硫酸钾（K₂SO₄）与硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）按3:1配比研磨混合；
（3）40%氢氧化钠溶液；
（4）2%硼酸溶液;
（5）1mol/L标准盐酸溶液/标准硫酸溶液;
（6）混合指示剂（田氏指示剂）：由50mL 0.1% 甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0.1% 甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存使用。酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄且灵敏。
三、实验步骤
1.样品处理
　　液体样品可直接吸取一定量，也可经适当稀释后，吸取一定量进行测定，使每一样品的含氮量在0.21.0mg 范围内。
　　固体样品应在105℃ 干燥至恒重。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作再继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直至两次称量数值不变，即达恒重。
2.消化
　　取一定量的样品，于干燥的凯氏烧瓶内。加入300mg 硫酸钾—硫酸铜催化剂，再加入5mL 消化液。用电炉加热，在通风橱中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加热，避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，至消化液清澈透明呈蓝绿色后，再继续加热微沸0.51h。
　　为了加快消化速度，待泡沫消失后，可添加双氧水，每次加45mL。注意，每次添加双氧水时，就从热源上取下定氮瓶，待消化液冷却至 7080℃ 后，方可加入30% 浓度的双氧水。
蛋白质+13H₂SO₄→(NH₄)₂SO₄+6CO₂↑+12SO₂↑+16H₂O
3.蒸馏
　　待消化液冷却至室温后移入容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容。将凯氏蒸馏装置用水蒸气清洗干净，取一定量的消化液置于蒸馏装置反应室中，加入氢氧化钠使其呈碱性，硫酸铵在碱性条件下释放出氨，通过加热蒸馏，氨随水蒸气蒸出。
(NH₄)₂SO₄+2NaOH→2NH₃↑+Na₂SO₄+2H₂O
4.吸收
　　在锥形瓶中加入硼酸-田氏指示剂混合液，置于冷凝管口之下，冷凝管口应浸没在液面之下，以保证氨的吸收。锥形瓶中的硼酸会吸收蒸馏出的氨，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂会由紫红色变为绿色。变色后再蒸馏5min，让冷凝管口离开液面，再蒸1-2min 以冲洗冷凝管口。
2NH₃+4H₃BO₃→(NH₄)₂B₄O₇+5H₂O
5.滴定
　　待吸收完全后，用硫酸或盐酸标准溶液进行滴定，指示剂溶液由绿变淡紫色即为滴定终点。硼酸为极弱的酸，在滴定过程中并不会影响指示剂的变色反应。
(NH₄)₂B₄O₇+H₂SO₄+5H₂O→(NH₄)₂SO₄+4H₃BO₃
(NH₄)₂B₄O₇+2HCl+5H₂O→2NH₄Cl+4H₃BO₃
6.计算
　　另取凯氏烧瓶一个，不加样品，重复以上步骤，作为空白实验，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。
　　根据硫酸或盐酸标准溶液消耗的体积，计算总氮含量，再乘以蛋白换算系数F，即为粗蛋白的含量。
X：样品中蛋白质的百分含量，g；
V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，mL；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL；
V：样品消解液总体积，mL；
V’：样品消解液蒸馏所用体积，mL；
c：盐酸或1/2硫酸标准溶液的浓度；
0.014：盐酸或1/2硫酸的标准溶液1mL相当于氮的克数；
m：样品的质量（体积），g（mL）；
F：氮换算为蛋白质的系数。
四、蛋白换算系数
　　由于蛋白质的含氮量通常被认为是16%，即在蛋白质样品中，1 g氮相当于6.25 g蛋白质，所以用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25，即可得到样品中的蛋白质含量。这种方法的操作比较简单，检测的浓度下限低，应用十分范围广。但在实际中，由于样品中的各种蛋白质的氨基酸组成不同，这就造成了样品的含氮量不同，换算时直接乘以蛋白质含量平均系数6.25会降低检测的准确性。为了得到更准确的蛋白含量，经长期实验积累，对常见样品的蛋白系数有了更为准确的换算系数，具体蛋白换算系数可参考下表：
五、结果示例
1.空白样品滴定结果

2.实验样品滴定结果

3.结果计算
六、参考文献
[1] Lynch J M , Barbano D M .Kjeldahl nitrogen analysis as a reference method for protein determination in dairy products.[J].Journal of Aoac International, 1999(6):1389-1398.
[2]AOAC Official Method 2001.11, Protein (Crude) in Animal Feed,Forage (Plant Tissue), Grain, and Oilseeds[S]. Association of Official Analytical Chemists Method.
[3]ISO 20483:2006, Cereals and pulses―Determination of the nitrogen content and calculation of the crude protein content―Kjeldahl method[S]. International Organization for Standardization Method.
[4]GB/T 5511-2008, 谷物和豆类含氮量测定和粗蛋白质含量计算-凯氏定氮法[S]. 中华人民共和国国家标准.
[5]GB 5009.5-2010, 食品安全国家标准-食品中蛋白质的测定[S]. 中华人民共和国国家标准.
[6]GB/T 21704-2008, 乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定[S]. 中华人民共和国国家标准.

本文原文来自bilibili