小分子化合物动物给药计算方法详解

小分子化合物动物给药计算方法详解

在生物医学研究中，小分子化合物的动物给药实验是常见的研究手段。本文将详细介绍小分子化合物动物给药计算方法，包括mpk的定义、等效剂量计算关系、常用动物实验中的给药体积、常用给药方式及特性、常用溶媒及原理、动物给药计算方法等。

1. mpk

mpk指'milligrams per kilogram'（毫克/千克）（药物质量毫克/动物重量千克）指每千克动物体重给予的药物毫克数。这个单位有助于标准化剂量，使得不同体重或不同种类的动物之间的剂量可以进行比较。

以小鼠为例： 10mpk=10mg/kg=10ug/g，每千克体重的小鼠将接受10毫克的药物

2. 等效剂量计算关系

一般实验动物种类、重量范围、体表面积：

表格说明：

• Working Weight Range 为一般给药时小鼠重量范围。
• Km（a）：转换因子 Km 的单位是 kg/m2；通过将物种的平均体重（kg）除以其体表面积（m2）所得。
• 动物 A 剂量 (mg/kg) = 动物 B 剂量 (mg/kg) × 动物 B 的 Km /动物 A 的 Km
  例如化合物 X 在小鼠的剂量为 20 mg/kg, 折算成大鼠的给药剂量：
  大鼠剂量 (mg/kg) = 小鼠剂量 (20 mg/kg) × 小鼠的 Km 系数 (3)/ 大鼠的 Km 系数 (6) = 10.0 mg/kg
• 上述换算方案供参考：不同药物除了代谢本身之外，不同动物之间存在多方面的差别 ( 药物的吸收、分布、转化、排泄等方面都可能有差距 )
• Km 为转化因子估计值，与动物中的实测和计算值并不一定相等。

3. 常用的动物实验中的给药体积

• 在接近体积限制或静脉给药 IV 时，必须考虑溶液的性质，如 pH 等。推荐的工作范围为 pH 为 4.5 至 8.0。
• 不同给药途径对 pH 的耐受程度依次为口服> 静脉注射> 肌肉> 皮下> 腹腔。还须考虑动物本身健康状况，如肾功能和心血管功能，静脉滴注或者接近体积限制时这些系统必须正常才能增加体积。
• 每天不应使用超过两个肌肉注射部位。皮下注射部位应限制在每天两到三个。
• 黄色标注：为了适应更大的体积，可以随时间分开（例如，每天 4 次，每次 20 mL/kg，以在 24 小时内达到总量 80 mL/kg）。
• 蓝色标注：如果使用的体积大于常见使用体积，建议将该体积划分到多个站点。
• 红色标注：分为多个站点和交替腿，每条腿最多 5 个站点。最终体积不超过 0.10 mL；也可以随时间给药（例如，每天 4 次给药，剂量为 10 mL/kg，以在 24 小时内达到总量 40 mL/kg）。
• 紫色标注：不经常使用。
• NIA 缩写：无可用信息。

4. 常用给药方式及特性

5. 常用溶媒

• 在溶媒选择时可优先参考对照化合物的专利或文献，其次再选择尝试不同的溶媒。
• 在PK研究中，药物通常以均一溶液或混悬液的形式给药，不同的配方会在不同程度上影响药物在体内的溶解性和渗透性。
• 常见的给药方式包括静脉注射（IV）、口服（PO）、皮下（SC）、腹腔（IP）等，其中，IV等血管内配药必须是澄清透明溶液，而PO溶液状态需是透明溶液或者均一混悬液。
• 严格的溶媒选择需要根据研究目的、剂量、给药途径、制剂要求、动物种属、药物化合物状态等决定。
• 溶媒的选择以及用量与化合物的性质有关，若已知药物化合物结构或者相关理化性质如解离常数（pKa）、表面特性、吸湿性、水中溶解度等，这些参数可以对溶媒的选择提供一些指导作用。如利用化合物结构中的亲水基团或者疏水基团可以对化合物的水溶性作初步判断。
• 溶媒选择首先从水性缓冲液开始，如果没有良好的溶解性，再改用其他溶液方法：助溶剂，环糊精，胶束等，特别注意pH值与这些辅料的联合使用。
• 一般考虑顺序为：单一溶媒-调节pH -助溶剂-表面活性剂-新配方（在配药过程中，要按照配方顺序依次加入，且每加入一种溶剂，都要充分振荡，或者辅助加热、超声、调节PH等手段，以确保溶液溶解为均一状态。）
• 1. 单一水性缓冲液作为溶媒：如水，生理盐水，pH2~9的buffer等。
• 2. 调节pH：pH缓冲液适用于在生理pH值29下电离的弱酸或弱碱。药物配制时的pH值由药物溶解度和药物溶液稳定性决定，按照化合物的一般规律，碱性基团多时降低pH可以提高溶解度，酸性反之。需要注意的是：极端pH值可能会产生生物相容性问题，如组织刺激、药物沉淀。对于各种动物物种，期望制剂中的缓冲系统不会破坏动物全身循环中的pH/缓冲液平衡。一般来说，pH 29的范围是可以接受的。
     如下图药物的酸碱性占比中，酸性占比20%，碱性占比75%。多数药物分子是可以解离的弱酸或弱碱，所以调节pH值是使难溶性药物解离的一种简单有效的增溶方法。因此缓冲液得到了广泛的应用，如：柠檬酸缓冲液（Citrate Buffer），醋酸缓冲液（Acetate Buffer），磷酸缓冲液（PBS）等。不同的给药途径对pH值有不同的限定。通常口服制剂给药的pH值应在2～11的范围内，不过pH在4～8的制剂更常见，刺激性较小。静脉给药的pH值相对缩小，以减小对血管的刺激，应在3～9的范围内。
• 3. 助溶剂：当使用单一溶媒不能完全溶解时，就需要考虑在配方中加入助溶剂，从而促进大多数水溶性差的药物化合物的溶解能力，保证药物在体内外的溶解性及稳定性，提高药物的溶出度和生物利用度。优先选择的助溶剂有环糊精、甲基纤维素（MC）等，极性较大的助溶剂有DMSO、N，N-二甲基乙酰胺（DMA）和N-甲基吡咯烷酮（NMP）等，极性稍小的助溶剂有乙醇、PG（丙二醇）和PEG（聚乙二醇）等，助溶剂与pH调节的联合使用可以显著增加药物的溶解度。
• 环糊精（CD）被广泛应用于难溶性药物的增溶，其独特的笼状结构可以形成主客分子复合物，非极性药物分子位于非极性的笼状结构内部，环糊精外部的多羟基与极性的水分子亲和力强，从而有增溶效果。作为药物的增溶剂最常用的是两种β-CD的衍生物：羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD）和磺丁基-β-环糊精(SBE-β-CD），其优点是提高药物的稳定性、水溶性、安全性、降低肾毒性、缓和药物溶血性、控制药物释放速率、掩盖不良气味等，是目前被FDA批准的仅有的两种可注射型环糊精辅料。
• 4. 表面活性剂的使用：表面活性剂可以提高药物溶解度、通过形成胶束来增加非极性药物在水中的溶解度；同时由于药物在胶束中与水分子的接触减少，增加了稳定性；在含蛋白质的制剂中还可以减少蛋白质的降解。改善药物颗粒润湿和溶解、减少或消除药物沉淀、减少药物降解、调节药物释放、促进药物更新等。表面活性剂以多种剂型使用：溶液、胶体体系(乳液、微乳液等)、胶囊/片剂等。常规的表面活性剂包括吐温80、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)等。
     
• 1.聚氧乙烯醚（35）蓖麻油（Cremophor EL）：主要作为增溶剂，乳化剂，润湿剂，特别用于挥发油，脂溶性维生素及疏水性物质，作为非离子型表面活性剂，主要用于口服制剂，外用制剂和注射剂中。但是当静脉给药时剂量过高会导致在液质检测分析血浆时易产生大的基质效应。
• 2.吐温80：易溶于水，溶于乙醇、植物油、乙酸乙酯、甲醇、甲苯，不溶于矿物油。低温时成胶状，受热后复原。吐温80具有很强的破裂细胞膜的作用而引起刺激性，溶血性和组胺释放（致敏性）。吐温80用于注射剂，会引起过敏反应，包括休克，呼吸困难，低血压，血管性水肿，风疹等过敏样反应症状。
  注：表面活性剂的一个主要问题是会引起全身毒性，包括组胺释放和心血管副作用。并且，许多常规表面活性剂会干扰体内生物学过程，例如胃肠道渗透性增强、外排转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)的抑制。因此，在溶媒开发中，表面活性剂适用于低剂量应用，且少量的表面活化剂可以最小化或消除潜在的药物沉淀。
• 然而，配药并非给药，考虑到助溶剂和表面活性剂等的毒性，其用量应控制在尽量低的水平，表中是目前总结出来的一些溶媒使用的推荐范围。
• 给药（主要是注射）时的沉淀是溶液制剂的一个重大挑战，在没有确定的药物饱和时间的情况下，通常将配制好的vehicle在环境温度下放置24或48小时，观察溶液或混悬液的结晶情况。
• 为防止体外沉淀，一般措施为：
• 1、助溶剂之后再加水相，一般会减少超声时间，以防析出。
• 2、少量表面活性剂的存在干扰了结晶的形成，导致延迟、最小化甚至消除了结晶过程。因此，可以通过加入少量表面活性剂或甚至亲水聚合物来优化配方，以最小化或消除潜在的沉淀。
• 3、可以使用系列稀释法在体外沉淀中评估制剂，确保药物在注射前和注射时保持溶解。
• 4、现配现用，尽可能在动物给药前制备新鲜的制剂。
• 5、选择合适的储存环境。如储存温度，避光等。
• 在具体实验操作中，不仅要考虑药物是否溶解，还要考虑到各种添加物质在动物体内的耐受剂量范围、溶剂是否需要等渗、是否会在体内析出、配制药液的稳定性等多方面的问题。
• 常用配方：

6. 动物给药计算方法

我们以小鼠为例子：
通过了解以上两个表格可知小鼠的工作重量范围为11-34g，灌胃的给药体积一般为10mL/kg，

1. 问：给药剂量为10mpk, 小鼠个数n=3，计算需要多少化合物?
   答： ① 罗列已知信息：（小鼠灌胃体积一般默认为为10mL/kg，参考表格常用的动物实验中的给药体积），10mpk=10mg/kg, 个数n=3, 小鼠重40g=0.04kg
   ②计算：需要化合物量为：0.04kgx3x10mg/kg=1.2mg
   ( 注：小鼠体重可按照最大体重40g计算，为节约化合物也可以根据实际小鼠称重的最重小鼠重量计算，也可以多计算一只小鼠的个数n=4来计算，具体问题具体分析，这里我们以小鼠重40g计算。)
2. 问：给药剂量为10mpk, 小鼠个数n=3，化合物重量为1.2mg，溶媒为5%DMSO+（10%HP-β-CD+生理盐水），需要多少DMSO?多少HP-β-CD？
   答：①配置溶媒：10gHP-β-CD+100mL生理盐水=10%HP-β-CD+生理盐水
   ②计算需要溶媒体积：（小鼠灌胃体积一般默认为为10mL/kg，参考表格常用的动物实验中的给药体积）
   10mL/kg÷10mpk（10mg/kg）X 1.2mg=1.2 mL
   ③计算DNSO体积：1.2 mL X 5%=0.06 mL
   ④补充剩余体积10%HP-β-CD+生理盐水:1.2mL-0.06 mL=1.14mL

7. 作业

假设大家一起做一组大鼠PK实验：给药剂量分别为1mpk、5mpk、10mpk, 每组大鼠个数n=3，需要化合物重量为？溶媒为5%DMSO+30%PEG400，分别需要多少DMSO?多少PEG400？