细胞传代培养步骤及传代问题分析
细胞传代培养步骤及传代问题分析
细胞传代培养是一种重要的实验技术，其主要目的是维持和扩增特定类型的细胞群体，并为研究提供足够数量和质量的细胞材料。细胞在培养过程中会不断地增殖，但是培养容器的空间有限，细胞浓度过高时会出现接触抑制，影响细胞的生长状态，因此当细胞培养到一定的时间需要进行细胞传代的操作，把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶中，使得细胞能够继续扩增。
细胞培养的基本步骤
原代培养：从供体内取出组织，经机械或消化分离成单个细胞或单一型细胞群，在无菌、适当温度和营养条件下，生存、生长和繁殖。简单步骤为：剪切组织-消化分离-扩增培养。
传代培养：当细胞密度达到80%~90%时，去掉培养基，用PBS清洗，加入胰蛋白酶消化，分离细胞，再按一定比例接种到新的培养瓶中。一般2～3d后应换一次生长液。
体内细胞培养：将瘤细胞悬液接种到动物体内，形成肿瘤，再从肿瘤中分离细胞，进行培养。
细胞冻存：将细胞悬液与冻存液按一定比例混合，装入冻存管，放入-80℃冰箱，若需长期保存需要再转移到液氮中。
细胞复苏：将冻存细胞从液氮中取出，迅速在37℃水浴中解冻，加入预热的含血清的培养基，离心，弃上清液，加入新的培养基，放入孵箱中，培养。冻存与细胞复苏需要遵循慢冻速溶的原则。
需要注意，悬浮细胞和贴壁细胞的传代培养是不一样的。
贴壁细胞传代
对于贴壁细胞来说，它需要把上清去掉，用1-2ML的PBS洗一下细胞，然后用枪吸去洗涤液，然后加入胰酶进行细胞消化。（加入1-2ML的PBS， 我是会贴壁加入到培养皿的边缘，不能直接对着细胞加入PBS，容易把细胞都吹起来。这一步的目的是为了去掉残余的培养基的，残余的培养基会含有血清和一些离子等，不利于接下来的消化。此外，常见的是0.25%的胰酶。一般根据细胞皿的大小加入胰酶，对于10cm的dish，我会加入1ml的胰酶。）
放到37摄氏度培养箱30s-1min（我这里处理的是293T细胞，不同的细胞的消化时间是不一样的，需要具体的去查一查，如果消化的好的细胞是会呈现流沙状态的，上下晃动都会随着移动的。）
加入含有血清的培养液终止消化，用枪把培养液吹匀。（因为含有血清可以终止胰酶的消化反应，用枪吹培养皿底是为了把残留在底部的细胞吹起来）
转移到15ml的离心管中，离心，200g 5-10min(一般我是1000rpm离心3min)
去掉上清液，然后用PBS 重悬细胞，加入的PBS的量是10ML。再次离心，去掉上清。
加入适量的培养基，把细胞重悬，然后转移到培养皿里面。放入到37摄氏度的5%的二氧化碳培养箱。
悬浮细胞传代
- 对于悬浮细胞，达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。（GM12878非常典型，当然了，有的细胞不会聚集成团，比如说K562）
可以用台盼蓝溶液+自动细胞计数器或血细胞计数器，确定细胞的密度，计算需要添加的培养基体积，将培养物稀释至建议的接种密度。
一般是按比例稀释一下培养基，然后继续传代。（我在传K562的时候，是会1：4的比例去传代，保证细胞密度在1M/ML以下，能达到对数生长期，细胞处于旺盛的分裂期）
把细胞放入到37℃，5%的二氧化碳培养箱中，进行培养
传代问题解决方案
- 传代密度过高
一旦细胞养太久至融合度过高（>90%）才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。（如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象）
解决方案：
尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。
细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面（培养皿/瓶）所占的比例。
- 传代密度过低
哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。
解决方案：
细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度。