超详细解读——免疫组化实验原理、操作步骤和注意事项，新手快速入门必看！

超详细解读——免疫组化实验原理、操作步骤和注意事项，新手快速入门必看！

引用

丁香园

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免疫组化技术是一种在生物医学领域广泛应用的实验技术，主要用于检测特定蛋白质的表达和定位。本文将详细介绍免疫组化实验的原理、操作步骤和注意事项，帮助新手快速掌握这一重要技术。

什么是免疫组化

免疫组化技术，是一种抗原与抗体特异性的结合反应的技术。通过将荧光染料与特异性抗体相结合，制备出荧光标记的抗体探针。当这些探针识别并结合于目标抗原上时，会在荧光显微镜下观察到荧光信号，从而实现对目标抗原的精确定位及定量分析。
免疫组化技术在生物医药领域中具有广泛的应用，既可以用于检测特定蛋白质的表达和定位，也可以用于研究免疫反应和疾病发生机制。

免疫组化的应用范围

1. 免疫组织化学作为临床病理学中的一项关键检测技术，在诊断疑难病例和区分疾病中发挥着至关重要的作用。通过免疫组化技术，能够辅助医生区分肿瘤类型，精准定位肿瘤的原发部位，还能深入剖析组织病理学的细微特征，实现组织的分类。以及利用多种标志物进行研究和诊断软组织肿瘤。此外，免疫组化技术还可以发现微小转移灶，为疾病的早期诊断提供有力支持。
2. 在科研领域，免疫组化技术应用于鉴定组织形态，检测靶标的细胞定位和亚细胞结构层面的精定位，同时能够直观观测蛋白质的表达丰度。通过这一技术，科研人员能够深入了解细胞和组织的分子水平特征，为疾病机制和治疗研究提供重要信息和数据支持。

免疫组化的原理

1. 免疫组化技术是一种利用于抗体与抗原之间高度特异性的结合原理进行的技术。首先利用特异性抗体结合组织或细胞内的目标蛋白质。然后利用化学方法将抗体结合的位置显示出来。这样可以对未知抗原的定性，定位，定量分析。
2. 在免疫组化实验的操作中，选择合适的抗体是决定实验成功的关键一步。因为只有特异性抗体才能准确地识别目标蛋白，才能保障实验结果的精确性与可靠性。通过这一技术的运用，我们能够在组织或细胞水平上，观察到特定蛋白的位置和表达量，为科研人员提供了重要的信息与数据资源。有助于进一步的研究和诊断工作。

免疫组化的操作步骤

1. 脱蜡水化

脱蜡水化是为了去除切片上的石蜡，以确保染色的准确性和清晰度。
首先，将经过预热处理的石蜡切片置于恒温烘箱或专业烤片机内，于60°C条件下加热约30至60分钟，使蜡片中的水分蒸发和石蜡融化，从而使组织切片紧密粘附在玻片上。
然后，将切片依次浸入二甲苯溶液（Ⅰ）中浸泡10分钟，随后转移至二甲苯溶液（Ⅱ）中继续浸泡10分钟，以完成脱蜡处理。此双重脱蜡步骤有效确保了切片上石蜡的彻底清除，为后续的染色和分析提供清晰的实验结果。

2. 水化

水化是脱蜡之后的关键步骤，用于清除残留的脱蜡溶剂及二甲苯，并引导细胞切片逐步适应水性介质，为后续的染色和检测做准备。
首先将切片浸泡在无水乙醇（Ⅰ）中静置10分钟，随后更换为无水乙醇（Ⅱ）中继续浸泡10分钟。
然后，切片需按浓度梯度依次浸泡在95%乙醇、70%乙醇及50%乙醇溶液，各停留5分钟。最后，在蒸馏水中浸泡5分钟。
接着，将切片在PBS中的三次洗涤，每次持续3分钟。这些水化步骤有助于使细胞切片逐渐适应水性环境，为后续的染色及检测步骤提供了更为准确可靠的实验条件。

3. 抗原修复

在免疫组化实验的精细流程中，抗原修复环节占据着举足轻重的地位。当组织样本经历福尔马林等固定剂的固定处理及随后的石蜡包埋过程后，抗原决定簇往往会与核酸发生交联，导致抗原的空间结构发生改变，遮蔽了抗原决定簇，减少了抗体与抗原的结合位点，降低了抗原的检测率和着色强度。
这些交联作用在高温加热或蛋白酶水解的作用下可以发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程即是抗原修复。通过抗原修复技术，可以促使抗原决定簇重新暴露于细胞表面，增加其与抗体结合的机会，从而提升抗原的检测敏感性与结果的准确性。

4. 消除内源性过氧化物酶活性

通常在切片表面滴加3%浓度的H₂O₂溶液，随后封闭5至10分钟，去除组织中潜在的内源性过氧化物酶活性。
封闭处理完成后，用PBS对切片进行冲洗，冲洗三次，每次持续2至5分钟，以确保H₂O₂溶液及其反应产物被完全清除。这一过程有助于消除内源性过氧化物酶的活性，确保下一步的染色和检测过程的准确性和可靠性。

5. 非特定点位封闭

为防止一抗与细胞表面的非特异性结合导致假阳性结果，通常用牛血清白蛋白（BSA）或羊血清等高效封闭剂来实现。
这些封闭剂能够覆盖细胞表面的非特异性结合位点，避免一抗在实验过程中发生非特异结合。

6. 一抗孵育

在进行免疫组化实验时，由于实验耗时较长且步骤繁多，选择合适的一抗至关重要，它直接关系到实验能否获得清晰、准确的特异性染色结果及可靠的结论。
在选择一抗时，我们需遵循几项基本原则：选择具有特异性强、灵敏度高、背景低的抗体，确保结果的稳定性和重复性良好。
抗体的特异性体现在组织特异性、细胞特异性以及细胞亚定位的特异性。单克隆抗体具有较强特异性，但它的亲和力较小，在检测抗原时灵敏度较低。相比之下，多克隆抗体虽然特异性较弱，但其抗体的亲和力强，灵敏度高，很容易导致非特异性染色。

7. 二抗孵育

在免疫组化实验中，选择不同的显色系统可能会呈现出不同的显色效果。在二抗孵育过程中，需要注意调整适当的条件来确保显色效果的最佳展示。
不同的显色系统对应的显色效果有所不同。在二抗孵育完成后，根据显色效果对实验进行评估。若发现显色结果呈现深色背景或非特异性着色过强，往往提示二抗浓度或显色底物用量偏高，此时需适时降低其浓度，以减少非特异性干扰，提升结果的清晰度。反之，若显色效果过于微弱，不足以清晰展示目标抗原的分布与表达情况，则可能需要考虑增加二抗或显色底物的浓度，以增强信号强度，确保实验结果的准确传达。

8. 切片显色

选择不同的显色系统可以呈现出不同的显色效果。在切片显色过程中，通常采用DAB显色液进行染色。
DAB显色的时间并不是固定的。一般需要在显微镜下控制显色过程，如果观察到切片表面出现均匀的浅棕色底色，此时应立即进行冲洗，以固定显色效果并防止过度染色。
如果在短时间内（如几秒至几十秒）即出现深棕褐色，这往往是抗体浓度过高或孵育时间过长，此时需要调整抗体浓度或缩短孵育时间，以避免非特异性染色的增加。
另外，如果只需很短时间就出现强烈的背景染色，可能是由于前期封闭非特异性蛋白不完全，需要延长封闭时间。而如果DAB显色时间过长（超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能是由于抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗在4ºC条件下过夜）；另一方面可能是封闭时间过长。

9. 复染

在细胞染色实验中，为了更好地形成细胞轮廓并准确定位目标蛋白，可以采用苏木素或苏木精进行复染。
在复染过程中，一般能够在极短的时间内（几秒内）即可被染色。而细胞浆或细胞膜蛋白需要20-30秒，才能看到明显的染色效果。
染色完成后，建议用自来水冲洗切片，再用PBS缓冲液进行返蓝处理约5分钟，这样的处理步骤可以帮助清晰显现出细胞结构和目标蛋白的位置，提高染色效果的准确性和可靠性。
在实验过程中，根据实际情况及时调整染色时间和处理步骤，将有助于获得清晰的染色结果。

10. 脱水

在对切片进行脱水处理时，可以按照以下步骤进行：首先，依次将切片分别浸泡在50%、70%、95%的乙醇中，每种浓度的乙醇中浸泡5分钟。接着，将切片置于100%乙醇中浸泡10分钟，然后更换新的100%乙醇浸泡10分钟。最后，使用二甲苯浸泡10分钟，再更换新的二甲苯浸泡10分钟。
这样的脱水处理步骤有助于将样本中的水分逐渐置换为二甲苯，从而进行透明化处理，为后续石蜡浸渍作准备。

11. 封片

首先将切片捞出，加入适量的中性树胶进行封片。滴加一滴树胶在组织旁，并盖上一块玻片，注意要小心以避免产生气泡。树胶的使用量要适中，如果不慎滴加过多树胶，可以小心使用二甲苯擦拭多余的树胶，以保持封片的清洁和准确性。

注意事项

1. 样本处理的标准化流程：在进行实验之前，严格遵循标准化的样本处理和固定程序。确保每一步骤的精确执行，减少人为误差，提升实验的可重复性。
2. 抗体的品质与选择：抗体的质量直接关系到实验的特异性与灵敏度。同时，根据实验的需求，选择合适的抗原结合的抗体，确保检测结果的准确性。
3. 设立负空白对照：设立负空白对照组是实验必不可少的步骤。用于评估非特异性结合和背景信号，从而准确地识别目标抗原的阳性信号。
4. 正确的标记和染色方法：根据实验的需求，选择适合的标记方法，如荧光标记或酶标记等。确保得到清晰的信号和准确的结果。
5. 充分洗涤步骤：在每一步骤中充分洗涤细胞，以清除未结合的抗体，降低背景信号，提升实验结果的清晰度和准确性。
6. 结果解析：在解读实验结果时，要结合对照组数据进行比较与分析，确保实验结果的可靠性与准确性。