真实世界研究揭示NGS在乳腺癌精准诊疗中的重要价值
真实世界研究揭示NGS在乳腺癌精准诊疗中的重要价值
乳腺癌是女性癌症相关死亡的主要原因之一。近年来，随着医学技术的发展，越来越多的药物靶向性生物标志物和预测性生物标志物被开发出来。其中，下一代测序（NGS）技术在乳腺癌的精准诊疗领域扮演着至关重要的角色，并已成为针对TP53、PIK3CA、ESR1、BRCA1/2等常见突变基因检测的首选技术。近期，一项研究对NGS在乳腺癌真实诊疗环境中的应用进行了评估，研究结果显示NGS能够提供关于乳腺癌预测性生物标志物和药物靶向性生物标志物的重要信息。这些发现不仅推动了精准诊疗的进步，还为患者参与新药临床试验提供了更多可能性。
研究方法
研究者对2010年至2021年期间在三星医疗中心接受乳腺癌治疗的180例患者进行了回顾性分析。这些患者在活检或手术过程中采集的组织样本被用于进行下一代测序（NGS）。研究者详细分析了这些患者的组织病理学特征和基因特征。通过计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）以及正电子发射断层扫描（PET-CT）的影像学资料，依据美国癌症联合委员会第8版标准，研究者针对每位患者的初始临床分期和病理分期进行了精确判定。
组织病理学分析和免疫组化
本研究使用福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织进行组织病理学分析和免疫组织化学(IHC)染色。所有FFPE组织均使用苏木精和伊红染色。由3名乳腺病理学家（H.L.、Y.A.C.和E.Y.C.）审查详细的组织病理学特征。使用LeicaBOND-III系统(LeicaBiosystems,Wetzlar,Germany)对FFPE组织的4μm切片进行IHC染色，以染色雌激素受体(ER；6F11，1:300，Novocastra，NewcastleuponTyne，UK)、孕激素受体（克隆16，1:1,200，Novocastra）、p53(DO7，1:1,200，LeicaBiosystems)、Ki-67(MIB1，1:200，Dako，Carpinteria，CA)、细胞角蛋白5/6(D5/16B4，1:100，Dako)和VentanaBanchMarkXT平台(VentanaMedicalSystemsInc.，Tucson，AZ)，根据生产商方案进行HER2染色(4B5，VentanaMedicalSystemsInc.)。
使用QIAamp DSP DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从5μm FFPE切片中提取肿瘤DNA，并使用QUBIT dsDNA BR检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)对提取的DNA进行定量。对于靶标捕获，研究者根据生产商的方案使用了SureSelectXT自动化试剂盒(Agilent,SantaClara,CA)。使用条形码制备配对末端测序文库。为了验证基因组DNA的大小和质量，研究者使用了基因组DNA分析ScreenTape和基因组DNA试剂与Agilent4200磁带站(Agilent)。使用TG Next Seq500/550高输出试剂盒v2(Illumina,Inc.,SanDiego,CA)和TGNextSeq500/550中输出试剂盒v2(Illumina,Inc.)对文库进行测序。
自2018年3月起至2020年10月，本研究通过应用定制化的NGS面板CancerSCAN，对70例病例进行了分析。该面板针对与实体瘤相关的375个基因进行了靶向测序。使用基于杂交捕获的TruSight Oncology（TSO）500DNA/RNA NextSeq试剂盒（Illumina,Inc.）分析2020年11月至2022年7月为NGS研究收集的其他110例病例。CancerSCAN和TSO500均由同一技术人员进行，结果由同一病理学家（H.L.和E.Y.C.）分析。TMB定义为每兆碱基(Mb)的体细胞突变数。TMB＜10定义为低TMB，TMB≥10定义为高TMB。为了准确计算TMB，排除了所有同义SNV、Indels、CNAs和融合变体。在用TSO500检测的病例中，根据生产商的说明，使用130个均聚物微卫星位点评价微卫星不稳定性（MSI）状态。当不稳定部位的百分比≥20%时，将病例归类为高度微卫星不稳定（MSIH）。
研究结果
患者临床病理学特征
仅4例(2.2%)患者为男性，其余176例为女性。患者平均年龄为41.46岁，绝经前117例(65.0%)。34例患者在辅助化疗后出现局部复发或远处转移，136例患者在新辅助化疗(NAC)或姑息治疗期间出现疾病进展。其余10例患者中9例行NAC并显示部分缓解，1例未接受NAC。这10例患者在随访期间均未显示任何复发或远处转移的证据。平均随访期为64.02个月（6.20-289.87个月）。随访期间，77例患者死于该疾病，81例患者诊断为乳腺癌。仅22例患者无疾病证据。最常见的组织学诊断为无特殊类型的浸润性乳腺癌(159/180，88.3%)，其次为化生性癌(14/180，7.8%)和浸润性小叶癌(4/180，2.2%)。根据IHC结果将病例进行分层后，三阴性乳腺癌（TNBC）为96例(53.3%)，HR+/HER2-乳腺癌为72例(40.0%)。在本研究人群中，62例患者(34.4%)在姑息性化疗期间接受NGS，58例在NAC后，34例在手术和辅助化疗后，26例在诊断时接受NGS。
在研究样本中，95例(52.8%)来自手术(66，69.5%)或活检(29，30.5%)期间的原发性乳腺癌。另外85例样本(47.2%)取自转移性乳腺癌。从转移性乳腺癌获得的病例样本中，60例(70.6%)通过活检获得，25例(29.4%)在手术期间获得。最常见的转移部位是肝脏(27/85，31.8%)，其次是淋巴结(14/85，16.5%)、肺(12/85，14.1%)、胸膜(12/85，14.1%)和脑(6/85，7.1%)。
分子改变
最常检测到的SNV是TP53突变(123/180，68.3%)，其次是PIK3CA突变(51/180，28.3%)。CNAs中MYC扩增(36/180，20.0%)发生率最高，其次为CCND1扩增(22/180，12.2%)（图1）。HR+/HER2-乳腺癌和TNBC中分子改变的详细患病率总结见表1和表2。将本研究中分子改变的发生率与来自癌症基因组图谱(TCGA)和乳腺癌国际联盟分子分类学(METABRIC)的结果进行比较，通过cBioPortal访问。在HR+/HER2-乳腺癌中，ESR1的SNV频率在统计学上高于TCGA，TP53的SNV频率在统计学上高于TCGA和METABRIC（Benjamini-Hochberg校正p值<0.05）。HR+/HER2-乳腺癌的CNAs频率及TNBC的SNVs和CNAs频率差异无统计学意义。
图1. 临床病理学特征和基因改变的示意图
表1. 文献报道的乳腺癌中不同基因SNV、插入和缺失的发生率
表2. 文献报道的乳腺癌中不同基因扩增的频率
PIK3CA突变
本研究中28.3%(51/180)的患者检测到PIK3CA SNV，在1例患者中检测到PIK3CA扩增。关于PIK3CA SNV的详细信息总结见表3。最常见的PIK3CA突变为H1047R(43.1%，22/51)，其次为E545K(17.6%，9/51)、N345K(13.7%，7/51)和E542K(9.8%，5/51)。1例患者发现其他突变。在HR+/HER2-乳腺癌患者中，31/72例(43.1%)存在PIK3CA突变，11/96例(11.5%)TNBC患者存在PIK3CA突变。9例HER2阳性乳腺癌患者(9/12，75%)存在PIK3CA突变。HR+/HER2-乳腺癌、HER2阳性乳腺癌和TNBC中PIK3CA突变的详细分布如图2所示。在therascreen检测面板中，PIK3CA突变的比例为72.5%。在未包含在therascreen检测面板的PIK3CA突变中，N345K是检测到的频率最高的突变（50.0%）（图3）。根据IHC亚型校正后，预计34.7%(25/72)的HR+/HER2-乳腺癌患者可从磷酸肌醇3-激酶(PI3K)通路抑制剂中获益。
表3. PIK3CA突变的详细信息
图2. 基于免疫组化亚型的PIK3CA单核苷酸变异(SNVs)的分布。(A)HR+/HER2-乳腺癌。(B)HER2阳性乳腺癌。(C)三阴性乳腺癌。所有亚型中最常见的SNV是H1047R
图3. 基于therascreen检测面板的PIK3CA单核苷酸变异(SNVs)的分布。(A)therascreen检测面板中PIK3CA SNV的流行率。(B)未纳入therascreen检测面板的PIK3CA SNV的分布
BRCA1/2突变
6例(3.3%)患者发现BRCA1突变，13例(7.2%)发现BRCA2突变。为确认胚系突变，从84例患者中采集匹配的正常血样，并进行BRCA1/BRCA2测序。在这84例患者中，4例患者发现BRCA1胚系突变，5例患者发现BRCA2种系突变，NGS也检测到所有突变。4例仅通过NGS检测到BRCA2突变的患者被证实存在体细胞突变。在NGS检测中，发现BRCA1基因突变的6例患者中，有2例未进行使用匹配血样的BRCA1/BRCA2基因测序；同样，在检测出BRCA2基因突变的13例患者中，有4例未接受相应的测序检测。
ESR1突变
11例患者(6.1%)检测到ESR1突变，其中10例(5.5%)为HR+/HER2-乳腺癌，另1例为TNBC。ESR1突变患者的详细信息总结见表4。2例HR+/HER2-乳腺癌患者和1例TNBC患者既往未接受过内分泌治疗。1例患者有2个ESR1突变——E380Q/Y537D。ESR1突变详情如下：8例SNV，5例D538G，1例E380Q/Y537D，1例L536H，1例L536_Y537insH，3例融合，2例ESR1:CCDC170融合，1例ESR1:TAB2融合。
表4. ESR1改变的乳腺癌患者的临床特征
基于NGS结果的精准诊疗
根据NGS分析结果，13例患者(13/180，7.2%)接受了靶向治疗。该信息详见表5。4例患者携带BRCA1或BRCA2胚系突变，并接受PARP抑制剂治疗。在BRCA突变患者中，3例患者在临床试验中接受了治疗，另1例患者通过紧急试验新药扩大使用(e-IND)接受了靶向治疗。另外9例患者存在PIK3CA突变，并接受PI3K通路抑制剂治疗。在9例PIK3CA突变的患者中，6例患者可以通过e-IND获得PI3K通路抑制剂治疗，另外3例患者需要额外的分子诊断分析。
表5. 以精准医学为基础的靶向治疗
肿瘤突变负荷
平均TMB为7.37/Mb(0-68.7)，中位TMB为6.3/Mb。根据年龄（≤50岁vs.>50岁，7.03/Mb vs.8.29/Mb，p=0.426）、绝经状态（绝经前vs.绝经后，6.93/Mb vs.8.29/Mb，p=0.329）、样本是否来自转移灶（原发灶vs.转移灶，8.02/Mb vs.6.64/Mb，p=0.168），样本是否在治疗后获得（初始vs.治疗后，6.74/Mb vs.7.48/Mb，p=0.506）、NGS时间（初始vs.NAC后vs.复发时vs.姑息性化疗期间，6.74/Mb vs.7.05/Mb，vs.6.38/Mb vs.8.48/Mb，p=0.448）或亚型（HR+/HER2- vs.HER2阳性vs.TNBC，7.73/Mb vs.9.98/Mb vs.6.78/Mb，p=0.270）分层，其TMB之间无显著差异。11例患者为高TMB(6.1%)，高TMB病例的平均TMB为26.54（范围，10.90-68.70；中位数，22.00）。在使用TSO500检测的患者中，没有发现具有高或低微卫星不稳定性的肿瘤类型，这可能影响该患者群体的预后和后续治疗选择。
研究结论
NGS在乳腺癌精准诊疗中的重要性毋庸置疑，但真实临床环境中的普及性仍待进一步提高。不仅如此，鉴于NGS检测能够识别出预示侵袭性行为以及对内分泌治疗或靶向治疗耐药的预测性生物标志物，并且有助于发现可能使患者有机会参与临床试验的潜在药物靶向性生物标志物，从而对乳腺癌的预后进行预测。因此，NGS在晚期或转移性乳腺癌患者中的潜在价值，值得通过进一步研究来深入探讨。
本文原文来自医学界