流式细胞术从零开始说
流式细胞术从零开始说
流式细胞术（flow cytometery）是利用流式细胞仪（flow cytometer）对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒等进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析信息全面、分选纯度高、方法灵活等特点，可用于细胞大小、细胞颗粒度、DNA及RNA含量、蛋白质含量、细胞特异抗原、细胞活性、胞内PH值、细胞周期、细胞凋亡、细胞功能分析等的检测。
通过流式细胞术进行细胞凋亡分析
FITC Annexin V 染色的流式细胞术分析。 Human PBMC用 12 uM 喜树碱处理 4 小时。将细胞与 FITC Annexin V 在含有碘化丙啶 (PI) 的缓冲液中孵育，并通过流式细胞术进行分析。经过 2 小时的处理，主要有三组细胞：活细胞（FITC Annexin V 和 PI 阴性）和凋亡早期（FITC Annexin V 阳性和 PI 阴性）和 FITC Annexin V 和 PI 双阳性的细胞。
流式细胞术的基本原理
深入了解流式细胞术的基本原理，必须了解流式细胞仪，流式细胞仪的基本元件包括液路系统、光路系统以及电子系统三个部分。
液路系统
液路系统的作用是将样品排列成单列细胞/颗粒流，并使细胞/颗粒稳定高速的通过流式细胞仪的检测点，主要包含流动室+鞘液+废液+上样器+压力控制系统。
- 上样速度越高，样本中心液流（sample core）越粗，激光聚焦越差，分辨率越低 ；
- 定性测量一般对流速要求不高，例如免疫分型 ；
- 定量测量严格要求低速，例如细胞周期检测。
光路系统
流式细胞中的光信号主要分为两类：散射光信号和荧光信号。
1. 散射光信号
散射光信号是细胞的固有参数，不需要使用荧光标签；
- 前向散射光 (forward scatter)：FSC信号的强弱与细胞的大小相关；
- 侧向散射光（side scatter)：SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关；
FSC-SSC的作用：利用细胞大小和颗粒度初步区分细胞群、去除细胞碎片、去除黏连细胞。
从细胞进入激光照射区到离开，产生一个电脉冲信号。H是脉冲高度，代表脉冲信号的峰值；W是脉冲宽度，是指细胞通过激光照射区域的时间；A是脉冲信号的面积。
实际操作中，部分细胞与细胞会粘在一起，连续通过激光照射区，被仪器认定为一次信号，对我们最终的数据分析造成干扰。当粘连体出现测量高度不变，宽度和面积变为两倍，即出现FSC-Height不变，FSC-Area和Width增大的现象。
我们可以使用FSC-A与FSC-H来排除粘连体，正常单细胞通过流式细胞仪激光照射区时，H和A是成正比增大的，而粘连体通过时，H不变，A增大，因此，可通过细胞的FSC-A（Area）与FSC-H（Height）参数完美排除掉粘连体，也可以通过FSC-H与FSC-W来操作，但此种方法对于复杂样本（样本中各种细胞大小差异较大）不太适用，实际上，去除粘连体的重要步骤在样本制备阶段。
2. 荧光信号
在流式细胞术中，荧光信号的产生是由于特定的荧光素分子吸收一定波长的光后跃迁到激发态，然后释放光子（荧光）回到基态。了解荧光信号的产生以及各部分元件，有助于我们多色配色。
- 激光：提供单色光束，用于激发细胞中的荧光标记物，常见激光器有355nm（紫外）、405nm（紫色）、488nm（蓝色）、561nm（黄绿色）、633nm（红色）。有的流式细胞仪只配备488nm；有的流式细胞仪配备两种激光器如488nm与638nm。多色流式则可能需要更多的激光器。
- 滤光片：通常包括带通滤光片、长通滤光片、短通滤光片，带通滤光片。带通滤光片允许一个固定范围内波长的光通过。如BP530/30表示允许波长515nm-545nm范围的光通过，长通允许特定波长以上的光通过，特定波长以下的光不能通过。短通滤光片使特定波长以下的光通过。
- 分光棱镜：将激光器发出的光线和细胞散射或荧光发射出来的光线分开，确保不同颜色的荧光可以被不同的检测器准确地捕捉到。
- 荧光信号检测器：检测分光棱镜分离出的荧光信号。每个检测器对应一个特定的荧光波长，用于测量细胞中特定荧光标记物的强度。
电子系统
主要负责处理和数字化由光学系统检测到的光信号。
- 信号放大：当细胞或颗粒通过检测点时，激光束照射到它们上产生的光信号（包括前向角散射（FSC）、侧向散射（SSC）和荧光信号）被光电倍增管（PMT）或光电二极管（PD）探测到，并转化为电信号。这些初始的电信号通常很弱，需要通过信号放大器进行放大。
- 模数转换（ADC）：放大后的电信号通过模数转换器（ADC）转化为数字信号。ADC的位数（如14到24位）决定了信号的解析率和能转化的数值范围。
- 脉冲分箱（Pulse Processing）：每个细胞的所有参数的电压脉冲会被进行分箱，即按照一定的采样率和ADC的解析率，将模拟信号转换为数字信号，并存储为数据以备后续分析。
- 数据存储与分析：数字信号被传送到电脑，存储为数据文件，以备分析。这些数据文件通常以标准的流式细胞仪文件格式输出，如FSC数字数据文件。
流式细胞术常用荧光染料及其激发光和发射光波长
染料 | 最大激发光 | 最大发射光 |
|---|---|---|
MF450 | 405 nm | 450 nm |
BZY405 | 405 nm | 455 nm |
Pacific Blue | 405 nm | 455 nm |
BZY500 | 405 nm | 500 nm |
BZY515 | 405 nm | 525 nm |
MF500 | 405 nm | 525 nm |
MF510 | 405 nm | 525 nm |
MF540 | 405 nm | 525 nm |
AF488 | 490 nm | 525 nm |
FITC | 494 nm | 520 nm |
PE | 496 nm, 565 nm | 578 nm |
PE-CF 594 | 488 nm | 610 nm |
PerCP | 482 nm | 678 nm |
PerCP-Cy5.5 | 482 nm | 690 nm |
PE-Cy5.5 | 496 nm, 565 nm | 690 nm |
PE-Cy7 | 496 nm, 565 nm | 782 nm |
AF555 | 555 nm | 572 nm |
PE | 496 nm, 565 nm | 578 nm |
AF594 | 590 nm | 617 nm |
PE-Cy5 | 565 nm | 667 nm |
PE-Cy5.5 | 496 nm, 565 nm | 690 nm |
PE-Cy7 | 496 nm, 565 nm | 782 nm |
APC | 650 nm | 660 nm |
AF647 | 650 nm | 665 nm |
Cy5 | 650 nm | 670 nm |
APC-Cy5.5 | 651 nm | 700 nm |
APC-AF700 | 640 nm | 712 nm |
AF700 | 695 nm | 720 nm |
APC-Cy7 | 650 nm | 767 nm |