LNP凭什么能成为RNA的护卫队？
LNP凭什么能成为RNA的护卫队？
脂质纳米颗粒（LNP）是目前被认为最有效和首选的RNA纳米载体。LNP已成功进入临床用于RNA的递送，如LNP-mRNA疫苗已用于临床治疗COVID-19，这标志着RNA治疗的一个里程碑。
LNP的发展助推RNA成为疫苗顶流
RNA在体内能发挥多种强大功能，如翻译蛋白、干扰基因表达、介导蛋白互作、调节基因转录或翻译等。近年来，研究者们热衷于针对肿瘤、传染病等各种疾病的开发预防和治疗的RNA药物，RNA作为新兴的治疗药物拥有广阔而远大的发展前景。
RNA具有表达范围广、安全性高、规模生产容易、成本低等独特的优点。然而，RNA就如才智双全但略显文弱的宰相，将RNA送向临床面临不少挑战：
- RNA链带负电荷，而细胞膜表面也带负电荷，静电排斥使RNA分子难以穿过细胞膜进入细胞内。
- RNA分子，特别是线性mRNA分子极容易降解，体内多种酶都能将其迅速降解。
- mRN分子有较强的免疫原性，容易被识别为外源核酸激活免疫反应。
被称为mRNA2.0的环状RNA，因独特的闭环结构而稳定性更强，且免疫原性更低，一定程度上强化了RNA在体内的作用，有望替代线性mRNA成为RNA疫苗的主流。但作为药物在体内稳定发挥作用，RNA还需要安全、有效和稳定的递送系统。已有多种mRNA递送材料被开发，包括脂质、类脂质材料、聚合物和蛋白质衍生物等类型。其中装载RNA的脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticle，LNP）是目前被认为最有效和首选的RNA纳米载体。LNP已成功进入临床用于RNA的递送，如LNP-mRNA疫苗已用于临床治疗COVID-19，这标志着RNA治疗的一个里程碑。
图1：mRNA和脂质纳米颗粒发展的一些关键里程碑时间表
LNP-RNA的成分和结构
除了负载于内核中的RNA以外，LNPs通常包括四种成分：可电离脂质（Ionizable lipid）、胆固醇（Cholesterol）、辅助磷脂（Phospholipid）和聚乙二醇化脂质（PEG-lipid），它们共同包裹并保护内核的RNA。
图2：IVT mRNA经过LNP包封配制成疫苗流程示意图
可电离脂质（Ionizable lipid）——RNA的近身侍卫
可电离阳离子脂质在LNP中占总脂质的30-50%，分为三部分结构：胺基头部基团、疏水性尾部基团和内部连接片段。可电离阳离子脂质是通过静电相互作用启动自组装的第一步，也是LNP配方中的关键成分，RNA递送和转染效率的决定性因素。
可电离脂类在低pH值下可电离，带正电荷，但在生理pH值保持中性。利用这种pH敏感性有利于RNA的体内递送。根据阳离子脂质头部基团的胺基数量，可分为单胺基或多胺基脂质。此外，通过调整脂质尾部结构，如改变尾部数量、设计线性或分支结构以及引入不饱和或可生物降解的键，可增强效力或赋予特定功能。其中，最著名的DLin-MC3-DMA(MC3)、SM-102和ALC-0315三种阳离子脂质均是单胺基脂质，也是经FDA批准的唯三可用于RNA递送的可电离阳离子脂质。
图3：LNPs递送RNA的机制
胆固醇（Cholesterol）——RNA的护卫骑兵
LNP配方中，胆固醇通常占总脂质的20%-50%，主要存在于LNP的外壳，有较强的膜融合性，有助于增加LNPs的稳定性，并帮助细胞膜融合。对胆固醇结构的修饰和优化，可以提高LNPs的递送效率并赋予LNPs特定的功能。
磷脂（Phospholipid）——RNA的马车
磷脂作为结构脂，占LNPs的10-20%，辅助LNPs自组装和防止内涵体逃逸。辅助磷脂一般为的饱和中性磷脂，能自发组织成脂质双层，有利于提高LNPs的相变温度，从而维持LNPs膜的稳定性。与细胞膜一样，磷脂位于LNPs的外围，或在LNPs内核的外围。
PEG化脂质（PEG-lipid）——RNA的护卫枪兵
PEG化脂质是控制LNPs半衰期和细胞摄取的重要组分。由于PEG链的亲水性且较大的体积，在LNP组装过程中留在LNPs的表面，能改善LNPs的亲水性。PEG链为LNPs提供了外聚合层，以阻碍血清蛋白和单核吞噬细胞的吸附，延长LNPs在体内的循环时间，同时防止LNPs在血液中的积累和聚集。PEG化脂质另一个潜在作用是能令LNPs的表面功能化，改造的PEG化脂质使LNPs与配体或生物大分子的生物偶联，能赋予LNPs的靶向性功能，改变其药代动力学和药效学等。但过量的PEG化脂质会对LNPs的细胞摄取和转染不利，PEG链的长度也是决定LNPs降解和起效速率的重要因素。
LNPs的形成原理
LNPs是在微流控混合平台中，通过混合有机相与水相沉淀脂质而配制的。通常脂类溶解在乙醇中，RNA溶解在pH 4的柠檬酸盐或醋酸盐缓冲液中，混合两种溶液使可电离脂质质子化。质子化的脂质和阴离子RNA之间产生静电吸引。同时，由于脂质水溶性差而产生的疏水作用，驱动LNPs自发组装，并把RNA包裹其中。然后对LNPs进行透析或过滤，去除非水溶剂，使溶液达到生理pH。
LNPs的递送机制
LNP包封保护的RNA免受核酸酶切，提高RNA分子的稳定性。LNPs中可电离脂质和PEG化脂质在生理pH下呈中性，减少了与血清蛋白的非特异性相互作用。PEG链解离后，LNPs与血清中的ApoE形成脂质复合物，将其转运到表达低密度脂蛋白受体 (LDLR) 的细胞膜上。
LNP的中性脂质结构使其与细胞阴离子膜静电相互作用较少，有较好的生物相容性。LDLR介导LNPs胞吞，LNPs进入细胞。随着细胞内含水解酶的溶酶体分解外源大分子，pH降低形成偏酸环境。酸性环境下，可电离脂质质子化，带正电荷，其磷脂较小的两性离子头部和疏水链尾部形成锥形结构，促进LNPs膜向六方晶相转变，导致其脂质膜的不稳定，促进LNPs内核中RNA的释放。理想的药物载体一旦达到目的，就会迅速从体内清除。因此各种LNPs在可电离的脂质中一般都会加入可生物降解的设计，以促进其进入细胞后迅速降解。
已上市RNA药物的LNP对比
三种药物的LNPs都由上述四种典型的脂质类型以相似的摩尔比组成。三者仅是可电离脂质和PEG化脂质的结构有差异，而三种可电离脂质都有叔胺基团。
区别于MC3，ALC-0315和SM-102在脂质尾部有酯键。酯键的水解有助于快速消除和提高耐受性。因此，相比MC3，肌肉注射ALC-0315和SM-102后，能被更快地清除，并改善耐受性。
图4：LNP包封环状RNA结构示意图
LNP封装circRNA效果如何？
LNP封装和递送完整对circRNA同样具有很强的兼容性，LNPs为circRNA的递送提供了一个极具前景的平台。大量研究已证明LNP对circRNA递送的有效性。
魏文胜教授团队用LNP包封编码SARS-CoV-2受体结合结构域的circRNA开发预防COVID-19的疫苗，注射小鼠体内能诱发免疫反应并提供有效的保护（Qu et al., 2022）。
王泽峰教授团队对编码猴痘病毒表面蛋白的circRNA进行LNP包封后，注射小鼠体内能产生大量的中和抗体，有效对抗猴痘病毒（Zhou et. al., 2024）。
陈玲玲研究员团队通过尾静脉注射LNP-ds-cRNA到小鼠体内，证明了LNP-环状RNA的安全性，并实现了作为适配体的ds-cRNA对PKP异常激活相关炎性疾病小鼠模型银屑病的干预治疗（Guo et. al., 2024）。
参考文献
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