单病毒基因组学研究：核酸分子分选技术的关键作用

单病毒基因组学研究：核酸分子分选技术的关键作用

加州大学旧金山分校的科学家们开发了一种基于微流控单液滴分选技术的靶标核酸富集方法，该方法能够仅使用最小的先验目标信息，实现对长度超过10 kbp的分子进行百万倍富集。这一突破性技术为罕见靶点测序提供了新的解决方案，具有广泛的应用前景。

核酸分子分选技术

靶向测序通过将资源集中于感兴趣的分子，实现高灵敏度且经济有效的目标区域深度平行测序。通常，感兴趣的靶标或生物仅以百分之几的比例存在，而处于治疗中的病毒DNA更是以人基因组的十亿分之几的比例存在。为避免DNA测序的大量浪费，必须对靶标进行富集。然而，现有的PCR或杂交捕获方法在靶向富集能力和目标捕获长度方面存在诸多限制。

鉴于此，来自加州大学旧金山分校的科学家们开发了一种基于微流控单液滴分选技术的靶标核酸富集方法，实现了仅使用最小的先验目标信息，即可对长度超过10 kbp的分子进行百万倍富集。本研究通过对HIV感染者的HIV原病毒单个基因组进行分离和测序，充分证明了该方法的有效性。该方法适用于研究和临床应用中的罕见靶点测序，包括识别癌症相关突变或感染细胞的病毒测序。相关研究结果已发表在《Analytical Chemistry》杂志上。

实验设计

1. 将需要富集的DNA混合物、引物、探针及反应mix进行混合；
2. 利用数字PCR液滴包裹仪，将上述反应体系分割成单液滴；
3. 进行PCR扩增；
4. 通过微流控单液滴分选技术，富集阳性液滴并回收DNA；
5. 将回收的DNA与引物、探针及反应mix混合，再次进行PCR扩增；
6. 进行二次液滴分选；
7. 回收DNA，进行测序或qPCR检测。

实验流程

实验结果

1. 数字PCR扩增后进行单液滴阳性分选，成功从含有10⁷倍lambda DNA的背景中富集出ΦX174病毒基因组。第一轮富集度达到160倍，第二轮富集度高达16000倍。这一结果充分证实，单液滴分选技术与数字PCR联用，能够高效富集微量靶标基因组。

2. 将感染HIV病毒的细胞与非HIV感染细胞的基因组DNA（gDNA）混合，模拟潜伏感染HIV的浓度。随后，通过数字PCR与单液滴分选技术联用，富集并回收含有HIV的液滴。测序结果显示：

• 成功分离出含有完整病毒基因组的液滴，富集度高达600万倍；
• 不仅实现了单个病毒的分离和测序，还获得了整合的原病毒全长基因组；
• 确定了HIV在宿主基因ARIH2中的整合位点；
• 有效解决了抗逆转录病毒治疗期间低载量HIV的检测问题，为单病毒基因组学研究提供了强大的工具。

总结

数字PCR技术与单液滴分选技术联合用于富集微量核酸靶标测序，具有以下优势：

1. 能够仅凭借最小的已知序列信息，富集长度达≥100 kb的长片段分子，实现百万倍的富集效果。该技术可用于宏基因组样本中人类基因突变或自然产物基因簇的富集测序特征分析。
2. 该方法可检测任何核酸，包括通过添加逆转录步骤的RNA，能够实现对融合基因或低丰度变异的测序。
3. 能够对如HIV等罕见单一病毒基因组进行高灵敏度的回收和测序，为单个病毒基因组学的研究提供了强大的工具。