巨噬细胞在不同疾病下的功能变化及其激活和分化指南

巨噬细胞在不同疾病下的功能变化及其激活和分化指南

巨噬细胞是免疫系统的重要成员，它们在各种疾病中扮演着不同的角色。本文将介绍巨噬细胞的功能和作用机制，以及如何在实验室中诱导巨噬细胞并将其进一步分化为不同的亚型。

巨噬细胞：功能和作用机制

巨噬细胞是一种白细胞，其生命旅程开始于骨髓，在分化形成巨噬细胞后被释放到血液中，随着血液循环进入各个组织中，并分化成不同的类型，例如大脑中的小胶质细胞和肝脏的Kupffer细胞。

巨噬细胞的主要功能是吞噬细菌、病毒等病原体，也可以消灭生物体内的肿瘤细胞和死亡细胞，在生物体中发挥“清道夫”的作用。巨噬细胞还可以通过呈递抗原，分泌趋化因子和细胞因子的方式参与免疫反应，激活其他免疫细胞。此外，巨噬细胞参与组织修复，在移植器官的存活和排异中发挥作用。

但巨噬细胞也可能成为疾病的帮凶，促进肿瘤生长和转移，维持病原体在体内的存在，或导致组织损伤和炎症反应。

图1. 巨噬细胞吞噬细菌的过程。

巨噬细胞可根据微环境进一步极化为经典激活型1 (M1) 和替代激活型2 (M2)。M1巨噬细胞由促炎因子如IFN-γ、TNF-α、LPS和GM-CSF激活产生，分泌促炎细胞因子和一氧化氮以及活性氧(ROS)，促进炎症反应对对抗病原体感染。M2型巨噬细胞由抗炎因子产生，有助于组织修复、免疫调节和纤维化。

图2. M1型和M2型巨噬细胞。

巨噬细胞可以大致分为M1和M2两种亚型，M2可以进一步分为M2a，M2b，M2c和M2d四种表型。M1对抗病原体感染，诱导促炎反应。M2促进抗炎反应和肿瘤发展。另外，M2a主要介导组织修复；M2b负责免疫调节；M2c在吞噬作用中起作用，M2d参与肿瘤的血管生成。

巨噬细胞：如何诱导分化？

在实验室中通常从外周血单核细胞(PBMCs)或人急性单核白血病细胞THP-1开始，通过加入特定的分化因子，诱导它们分化为成熟的巨噬细胞。

从外周血液诱导巨噬细胞分化

外周血单核细胞可以从血样中通过密度梯度离心法获得。

具体步骤(供参考)：

1. 将分离得到的PBMCs加入含有15% FCS的10 mL RPMI 1640(含有penicillin，streptomycin和2 mM glutamine)。计数并将细胞浓度调节至1×107 cells/mL。
2. 将10 mL细胞悬浮液加入培养皿中。不要去除不贴壁的细胞。
3. 在37°C下用5% CO2的加湿培养箱孵育细胞。在2天和4天后更换新鲜的RPMI/15% FCS培养基。
4. 细胞在第6天时已经分化为巨噬细胞，并且牢固地贴壁生长。
5. 取出培养皿并加入10 mL冷PBS，并且置于冰上30 min。使用细胞刮刀，轻轻地将细胞从板上刮下。
6. 将细胞以250 ×g离心5 min，并重悬于RPMI/5% FCS中并铺板。
7. 用新鲜的添加有10% FCS的RMPI 1640更换培养基。
8. 加入10 ng/mL LPS和5 U/mL人重组IFN-γ(可诱导M1极化)或加入20 ng/mL人重组IL-4(可诱导M2极化)，在37°C，5% CO2下孵育24 h。
9. 去除上清液并更换培养基(新鲜的添加有5% FCS的RMPI 1640)。

图3. 从血样中分离外周血单核细胞(PBMCs)。

用THP-1细胞诱导巨噬细胞分化

除了从人血样中分离单核细胞进而分化得到巨噬细胞外，也可以直接诱导THP-1细胞分化，步骤如下：

1. THP-1细胞在含有10% FBS、2×10-3 M, L-Glutamine、1%抗生素-抗真菌溶液和50 × 10-6 M, 2-mercaptoethanol的RPMI 1640培养基中培养。
2. 在37°C下用5% CO2的加湿培养箱孵育细胞。
3. THP-1为悬浮细胞，倾向于高密度生长，需要偏高的密度维持较好的细胞状态，一般1:2半换液或者补液来传代，少离心，尽量使用高质量血清。

诱导巨噬细胞分化：

1. 将THP-1细胞接种在孔板中(密度为5 × 105cells/mL)，加入PMA(浓度为50-200 ng/mL)，处理细胞24 h以诱导分化。

图5. PMA(100, 200 ng/mL)诱导THP-1细胞贴壁和分化。

巨噬细胞极化：

1. M0静息巨噬细胞的极化：在用PMA处理细胞24 h后，用无血清培养基洗涤分化的贴壁细胞两次，然后在无PMA的培养基中静置24 h，以获得M0静息巨噬细胞。
2. M1经典激活巨噬细胞的极化：在用PMA处理细胞24 h后，用100 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ共培养细胞24 h，以获得经典激活的M1型巨噬细胞。
3. M2替代激活巨噬细胞的极化：在用PMA处理细胞24 h后，用20 ng/mL IL-4和20 ng/mL IL-13共培养细胞24 h，以获得替代激活的M2型巨噬细胞。

M1/M2型巨噬细胞的鉴定

形态学差异

• M1型巨噬细胞：较为扁平，细胞分布分散，伴有较多的假伪足。这些特点有助于它们识别和吞噬病原体。此外，M1型巨噬细胞的细胞质内含有大量溶酶体和消化酶，以便分解入侵的病原体。
• M2型巨噬细胞：多为圆形体，细胞表面的突起较少。M2型巨噬细胞的细胞质内含有更多的吞噬体和细胞器，这些结构参与清除死亡细胞和促进组织再生。

图6. M1型和M2型巨噬细胞的形态学特征。

表面标志物

• M1分泌产生促炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12，以及高水平的活性氧(ROS)和氮物质。
• M2分泌抗炎性细胞因子，如IL-10、CCL18和CCL22。M2型巨噬细胞还表达几种受体，如甘露糖受体CD206(或MRC1)、清除受体CD163、dectin-1和DC-SIGN。

小结

通过本文的介绍，我们不仅学习了巨噬细胞在不同疾病下的功能变化，而且深入探讨了其从单核细胞到成熟分化细胞的“升级之路”。巨噬细胞的分化和极化在疾病治疗中具有重要的意义，随着研究的进一步深入，我们也将揭开巨噬细胞的神秘面纱，为多种疾病治疗开发出新的靶点。

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