CRISPR/Cas9系统原理及基因敲除细胞株构建全流程解析

CRISPR/Cas9系统原理及基因敲除细胞株构建全流程解析

CRISPR/Cas9技术是近年来生命科学研究领域的一项重大突破，它不仅极大地简化了基因编辑的流程，还显著提高了基因编辑的效率和精度。这项技术的核心在于通过gRNA（导向RNA）引导Cas9核酸内切酶精准定位到靶序列，实现对DNA的定点切割和编辑。本文将详细介绍CRISPR/Cas9系统的原理及其在基因敲除细胞株构建中的应用流程。

CRISPR/Cas9系统原理

CRISPR/Cas9系统的运作机制基于gRNA（导向RNA）对靶序列的特异性识别，进而引导Cas9核酸内切酶精准定位至靶序列的PAM（原间隔短回文重复序列）上游区域实施切割。此切割操作致使靶位点DNA出现双链断裂，随后细胞会启动自身的修复机制，主要通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）两种途径对断裂位点进行修复。正是借助这一修复过程，实现了DNA水平上基因敲除、敲入或点突变等多样化编辑操作。

CRISPR/Cas9技术的变革意义与挑战

CRISPR/Cas9技术的问世，为基因功能研究开辟了全新路径，它能够促使目的基因产生功能性缺失突变，从而彻底改变了科学家探究目的基因的传统方式。借助该技术，在单个细胞层面精准引入突变，进而培育出CRISPR介导的基因敲除克隆细胞系，这些细胞系在探索蛋白质功能、剖析敲除基因后的效应以及研究生物试剂特异性等诸多领域发挥着不可替代的重要作用。然而，成功获取高质量且可复制的敲除克隆并非易事，在技术层面存在诸多挑战，从项目设计到单克隆验证，整个流程复杂且需反复优化。

CRISPR基因敲除细胞株标准工作流程

（一）设计基因敲除方案并制备敲除载体

精准设计基因敲除方案是整个流程的起点，需依据目的基因的结构与功能特性，确定最佳的敲除靶点。随后，精心挑选并制备适宜的敲除载体，确保载体能够高效表达gRNA以及携带Cas9核酸内切酶，为后续的基因编辑奠定坚实基础。

（二）细胞转染

细胞转染是将CRISPR基因编辑载体准确递送至目标细胞内的关键环节。面对众多转染方法，如电转、钙转、脂质体转染等，研究人员需依据细胞类型的特点，经过反复优化与调整转染条件，以实现高效、精准的转染效果。特别是对于干细胞、原代细胞以及免疫和造血细胞谱系等转染难度较高的细胞类型，深入了解其细胞特征，积累丰富的转染经验至关重要，否则可能因转染失败导致整个实验进程受阻。

（三）KO细胞的扩增

在成功转染后，获得的KO（基因敲除）细胞往往数量有限且混杂在大量未编辑细胞中。此时，需对KO细胞进行筛选与扩增，通过特定的筛选标记或细胞分选技术，将编辑成功的细胞分离出来，并在适宜的培养条件下进行大量扩增，以满足后续实验对细胞数量的需求，为后续的单克隆挑选与验证提供充足的细胞资源。

（四）挑单克隆细胞并扩增

挑单克隆是确保获得均质、单一基因型细胞群体的关键步骤。常用的挑单克隆方法有极限稀释法和单细胞荧光激活细胞分选（FACS）。极限稀释法成本较低，操作相对简便，但可能导致细胞应激反应较大；而FACS利用其特异性分离双阳性细胞的能力，效率更高，能更精准地筛选出目标细胞。在挑选单克隆后，需将单个细胞分别培养扩增，形成独立的克隆细胞系。此阶段，细胞的生长条件必须完全优化，任何微小的失误都可能导致珍贵细胞样本死亡，前功尽弃。

（五）KO验证

KO验证是基因敲除实验的收官之作，也是至关重要的一步。需从基因组、蛋白质组以及功能水平等多个维度对敲除细胞进行全方位表征与验证。在基因组水平上，可采用Sanger测序、新一代测序（NGS）以及qPCR等技术，精准检测基因编辑是否按预期发生；在蛋白质组水平上，蛋白质印迹（WB）和质谱分析能够直观确认目标蛋白的表达是否完全消失；对于功能研究，免疫组织化学、免疫细胞化学以及FACS等方法可进一步验证细胞在生理功能层面是否因基因敲除而产生相应改变。只有在基因水平、蛋白质水平以及功能水平上均获得理想的验证结果，才能宣告基因敲除细胞株构建成功。在实际研究中，蛋白质水平的验证尤为关键且难度较大，能否确保WB结果的可靠性，已成为衡量细胞敲除服务质量的核心指标。