一种长单链DNA及其制备方法和应用
一种长单链DNA及其制备方法和应用
天津大学研究团队开发了一种新型长单链DNA制备方法，该方法通过引入链霉亲和素修饰磁珠固定的单链DNA以及UCNP修饰的单链DNA，实现了两条DNA单链的高效顺序连接。这种方法不仅提升了单链DNA合成的长度，打破了化学合成长度的限制，而且不依赖模板，减少了DNA二级结构对DNA延伸与连接的影响，在合成生物学和DNA数据存储领域具有重大意义。
本公开涉及生物，尤其涉及一种长单链DNA及其制备方法和应用。
背景技术
- 单链DNA是以单链状态存在的DNA，单链DNA在分子流体力学性质、吸收光谱、碱基反应性质等方面都和双链DNA不同，是生命科学研究领域中的一个重要工具，在荧光原位杂交（FISH）、CRISPR-Cas9基因编辑和DNA纳米技术等领域具有重要的应用价值。目前，单链DNA的制备方法可以根据是否借助聚合酶链式扩增技术（PCR）分为化学合成和酶法合成两类。基于固相亚磷酰胺“脱保护、偶联、盖帽和氧化”四步法的化学合成技术是目前广泛使用的DNA单链合成方法，该方法合成的极限长度约为200nt，虽然微阵列芯片合成法实现了更高通量的DNA合成，但合成技术在本质上并没有改变。DNA酶法合成技术有望改变这一局面，实现在更温和条件下以更低的成本合成更长的DNA分子。到现在为止，仍缺乏一种简单易行、普适性强、同比效率高的长单链DNA制备方法，来满足单链DNA合成市场的需求。
技术实现思路
本公开提供了一种长单链DNA及其制备方法和应用，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
根据本公开的第一方面，提供了一种长单链DNA的制备方法，包括以下步骤：
S1：固定ssDNA1；
S2：提供连接有PolyC序列的UCNP（稀土上转换纳米颗粒）；将带有PC键的ssDNA2与所述连接有PolyC序列的UCNP混合，使所述PC键与所述UCNP连接，形成ssDNA2-PC-UCNP-PolyC复合物；
S3：将所述ssDNA1、所述ssDNA2-PC-UCNP-PolyC复合物和DNA连接酶混合，使ssDNA1和ssDNA2连接；光照去除PC-UCNP-PolyC复合物，得ssDNA1-ssDNA2；
S4：重复步骤S2和S3，以连接下一个单链DNA，从而得到所述长单链DNA。
在一可实施方式中，步骤S1中，所述ssDNA1的5’端修饰有生物素；将所述ssDNA1与链霉亲和素修饰的磁珠混合，所述生物素与所述链霉亲和素结合从而完成对所述ssDNA1的固定。
具体地，所述ssDNA1与所述链霉亲和素修饰的磁珠混合的温度为37～40℃，转速为450～500rpm，时间为2～2.5h。
在一可实施方式中，步骤S2首先将所述PolyC序列与所述UCNP混合，离心，去除上清液后制成所述连接有PolyC序列的UCNP。
具体地，所述PolyC序列与所述UCNP混合的温度为37～40℃，转速为450～500rpm，时间为2～2.5h。
具体地，所述离心的转速为12000～12500rpm，时间为10～12min。
在一可实施方式中，步骤S2将带有PC键的ssDNA2与所述连接有PolyC序列的UCNP混合的温度为37～40℃，转速为400～450rpm，时间为2～2.5h。
在一可实施方式中，步骤S2将带有PC键的ssDNA2与所述连接有PolyC序列的UCNP混合后，将混合液离心，去上清，制得所述ssDNA2-PC-UCNP-PolyC复合物。
具体地，所述离心的转速为12000～12500rpm，时间为10～12min。
在一可实施方式中，所述ssDNA1和所述ssDNA2的长度均为70～100nt。
在一优选的实施方式中，所述ssDNA1和所述ssDNA2的长度均为80nt。
在一可实施方式中，步骤S3所述DNA连接酶选自T4 DNA连接酶。
在一可实施方式中，步骤S3将所述ssDNA1、所述ssDNA2-PC-UCNP-PolyC复合物和所述DNA连接酶混合反应的温度为16～18℃，时间为12～14h。
在一可实施方式中，步骤S3采用300～350nm波长的紫外光照射5～8min，以去除所述PC-UCNP-PolyC复合物。
在一可实施方式中，步骤S3经所述光照后，用磁铁吸附所述磁珠，去除上清液；洗脱，磁铁吸附磁珠后的上清液中即得所述ssDNA1-ssDNA2。
具体地，所述洗脱的步骤包括：向磁珠中加入EDTA，pH8.0～8.2和95％甲酰胺溶液，于90～95℃反应10～12min。
具体地，PC键是一种光裂解键，因此经光照后，可以使PC键裂解，从而去除PC键连接的基团。此外，PolyC序列的加入也可实现在紫外光下断裂，从而实现光照控制；且在ssDNA1与ssDNA2连接过程中，PolyC还可以起到3’端封闭作用。
在一可实施方式中，步骤S4重复步骤S2和S3的次数≥1，这样可使长单链DNA由≥3个短片段的单链DNA连接而成，从而使长单链DNA的长度在200nt以上。
根据本公开的第二方面，提供了根据上述制备方法制得的长单链DNA。
根据本公开的第三方面，提供了上述长单链DNA在非诊断、非治疗目的的原位杂交、基因编辑、DNA纳米、DNA探针的至少一方面中的应用。
根据本公开的一种可实施方式，至少具有以下有益效果：
本公开通过引入链霉亲和素修饰磁珠固定的单链DNA以及UCNP修饰的单链DNA，通过DNA连接酶实现两条DNA单链的高效顺序连接，提升了单链DNA合成的长度，打破了化学合成长度的限制，不依赖模板，减少了DNA二级结构对DNA延伸与连接的影响，在合成生物学和DNA数据存储领域具有重大意义。该方法无任何核酸修饰，无需使用特殊的装置或实验操作，普适性强，可以满足常规的实验室合成需求。
应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。
技术特征
一种长单链DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述ssDNA1的5’端修饰有生物素；将所述ssDNA1与链霉亲和素的磁珠混合，所述生物素与所述链霉亲和素结合从而完成对所述ssDNA1的固定；
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2首先将所述PolyC序列与所述UCNP混合，离心，去除上清液后制成所述连接有PolyC序列的UCNP；
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2将带有PC键的ssDNA2与所述连接有PolyC序列的UCNP混合的温度为37～40℃，转速为400～450rpm，时间为2～2.5h。
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2将带有PC键的ssDNA2与所述连接有PolyC序列的UCNP混合后，将混合液离心，去上清，制得所述ssDNA2-PC-UCNP-PolyC复合物；
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述ssDNA1和所述ssDNA2的长度均为70～100nt。
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3将所述ssDNA1、所述ssDNA2-PC-UCNP-PolyC复合物和所述DNA连接酶混合反应的温度为16～18℃，时间为12～14h；
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，重复步骤S2和S3的次数≥1，所述长单链DNA由≥3个短片段的单链DNA连接而成，所述长单链DNA的长度在200nt以上。
根据权利要求1～8任一项所述制备方法制得的长单链DNA。
权利要求9所述长单链DNA在非诊断、非治疗目的的原位杂交、基因编辑、DNA纳米、DNA探针的至少一方面中的应用。
技术总结
本公开属于生物技术领域，提供了一种长单链DNA及其制备方法和应用。制备方法：固定ssDNA1；将带有PC键的ssDNA2与连接有PolyC的UCNP混合，形成ssDNA2-PC-UCNP-PolyC复合物；将ssDNA1、上述复合物和DNA连接酶混合；光照去除PC-UCNP-PolyC，得ssDNA1-ssDNA2；重复上述步骤，以连接下一个单链DNA。还公开了根据上述方法制备的长单链DNA，及其在原位杂交、基因编辑、DNA纳米、DNA探针中的应用。本公开提升了单链DNA合成的长度，打破了化学合成长度的限制，不依赖模板，减少了二级结构对DNA延伸与连接的影响。该方法无任何核酸修饰，普适性强。
技术研发信息
技术研发人员：仰大勇,姚池,谭维,贾雪梅,李帅
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：
技术公布日：2024/11/26