IL-2蛋白的表达与纯化研究

IL-2蛋白的表达与纯化研究

白细胞介素2（Interleukin-2, IL-2）是T细胞分泌的重要细胞因子，在免疫调节中发挥关键作用。为了研究IL-2的功能及其临床应用潜力，获得高纯度的重组蛋白至关重要。本文详细介绍了IL-2蛋白的表达与纯化方法，包括基因克隆、蛋白表达、提取、纯化及活性验证等关键步骤。

白细胞介素2（Interleukin-2, IL-2）是T细胞分泌的重要细胞因子，参与调节免疫反
应中的T细胞增殖、激活和分化。IL-2不仅能够增强效应T细胞（Teff）的增殖，还
能促进调节性T细胞（Treg）的生成。为了研究IL-2在免疫调节中的功能及其在临
床应用中的潜力，获得高纯度的IL-2重组蛋白是必不可少的基础。本研究旨在详细
介绍IL-2蛋白的表达与纯化方法，确保其功能活性和纯度。

材料与方法

1. 基因克隆与质粒构建

为了表达IL-2蛋白，首先从公开数据库（如NCBI）获取人IL-2基因的cDNA序列。
使用PCR技术扩增IL-2基因，并设计特异性引物来确保扩增产物的准确性。随后，
将扩增的IL-2基因插入到带有His标签的表达载体（如pET-28a）中，His标签的存
在便于后续蛋白纯化。

扩增后的重组质粒通过测序验证插入片段的正确性，并转化至大肠杆菌感受态细胞
中扩增质粒。

2. 蛋白表达

将经过验证的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株，用于表达IL-2蛋白。具体
步骤如下：

在含有适当抗生素的LB培养基中培养转化的BL21细菌，直到OD600达到0.6-0.8。
此时细菌处于对数生长期，适合进行蛋白诱导。

加入1 mM IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导IL-2蛋白的表达。为了提高蛋白
的可溶性，诱导温度选择在16°C至25°C之间，诱导时间为12-16小时。

3. 蛋白提取

诱导表达的菌体通过离心收集，并使用裂解缓冲液（如Tris-HCl缓冲液，pH 8.0，
含有NaCl和蛋白酶抑制剂）进行裂解。裂解方法采用超声波破碎或高压均质仪，
保细胞完全裂解，释放蛋白质。

裂解后，进行高速离心（约15,000 g，30分钟），分离可溶性蛋白质和细胞碎片。
收集上清液，这其中含有表达的可溶性IL-2蛋白。

4. 蛋白纯化

IL-2蛋白带有His标签，因此可以采用镍亲和层析柱进行纯化。具体纯化步骤如下：

将含有IL-2蛋白的上清液装载至预先平衡的Ni-NTA（镍-硝基三乙酸）亲和层析柱
上。Ni-NTA能够通过其与His标签之间的特异性相互作用，捕获目标蛋白。

使用低浓度咪唑（20-40 mM）的洗脱缓冲液去除非特异性结合的杂质蛋白。

使用高浓度咪唑（200-300 mM）洗脱结合的IL-2蛋白。咪唑能够竞争His标签与Ni-
NTA之间的结合，从而洗脱出目标蛋白。

洗脱出的IL-2蛋白需要进一步透析或使用超滤离心管去除咪唑，换成适合储存和后
续实验的缓冲液（如PBS）。

5. 蛋白质鉴定与纯度分析

纯化后的IL-2蛋白通过SDS-PAGE分析其分子量及纯度。理论上，IL-2蛋白的分子
量约为15-18 kDa，His标签的存在可能会使蛋白的迁移率略有变化。

此外，为了确认IL-2的特异性表达，可通过Western Blot进行进一步验证。使用针
对His标签或IL-2的特异性抗体进行蛋白质检测，确认纯化的蛋白即为目标蛋白IL-
2。

6. 蛋白质浓度测定

使用BCA法或Bradford法测定纯化后IL-2蛋白的浓度。通过与标准曲线对比，确定
样品中IL-2蛋白的浓度，确保后续实验中能够使用已知量的重组蛋白。

7. 蛋白活性验证

为了确保纯化的IL-2蛋白具有生物活性，可以在体外通过刺激T细胞增殖的实验进
行功能验证。通常使用MTT或CCK-8检测方法测定IL-2对T细胞增殖的促进作用。

活性IL-2能够有效刺激T细胞的增殖，显示其在免疫反应中的功能性。

结果与讨论

通过大肠杆菌表达系统成功表达并纯化了人重组IL-2蛋白。SDS-PAGE显示纯化后
的IL-2蛋白具有良好的纯度，分子量约为15 kDa，与预期一致。Western Blot实验
进一步验证了IL-2蛋白的特异性。

IL-2的体外活性检测结果显示，纯化的IL-2蛋白能够显著促进T细胞的增殖，证明其
生物功能得到了保留。

大肠杆菌表达系统具有高效、成本低、操作简便的优点，使其成为表达重组蛋白的
常用系统。尽管大肠杆菌系统可能存在蛋白折叠不完全或失活的风险，但通过优化
表达条件（如低温诱导表达），可以有效获得功能性蛋白。