10种常见PCR技术，10分钟带你了解它们的区别

10种常见PCR技术，10分钟带你了解它们的区别

聚合酶链式反应（PCR）是一种广泛应用于分子生物学、医学诊断和生物技术领域的核酸扩增技术。本文将介绍10种常见的PCR技术，包括它们的原理、特点和应用，帮助读者全面了解这一重要技术的不同变体。

一、热启动PCR（Hot Start PCR）

1. 原理：在反应构建过程中抑制热启动Taq聚合酶活性或修饰dNTP聚合，直至热激活步骤启动。在允许室温构建反应的同时，不会出现非特异性扩增和引物二聚体形成。
2. 特点：防止引物结合到同源性低的模板序列上进行延伸（错配）；在反应体系配置过程中防止引物相互结合之后的延伸（形成引物二聚体）；增加靶片段的灵敏性和产量；在高通量或自动化液体处理平台上进行PCR体系配置，因为反应在室温下稳定，不会影响特异性。
3. 应用：主要用于基因表达分析、病原体检测和突变位点鉴定等方面的研究。

二、巢式PCR（Nested PCR）

1. 原理：利用第1轮PCR产物作为第2轮PCR的模板，除使用第1轮的1对特异引物之外，在第2轮PCR反应中，使用1对新的特异引物，它们与模板DNA的结合位点处于第1轮引物扩增出的DNA片段内，这样在第2轮中错误扩增的可能性极低。(目前还包括常规巢式PCR、半巢式PCR、反转录巢式PCR、共有序列巢式PCR、种特异巢式PCR等多种方法）。
2. 特点：克服单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大提高了PCR的敏感性；由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性；能保证整个反应的准确性及可行性。
3. 应用：常用于微生物学、生物信息学、生物医学等方面的研究。

三、降落PCR（Touchdown PCR）

1. 原理：根据引物的Tm值，设置一系列从高到低的退火温度，且需将前面几个循环的退火温度设定为高于引物的最高熔解温度（Tm）。较高的温度有助于避免产生引物二聚体及非特异性引物-模板复合物的形成，因此可减少非特异扩增。
2. 特点：低水平、高特异性的扩增在循环早期，此时的退火温度高于“最合适”的退火温度；当退火温度在目的产物的Tm值与假阳性产物的Tm值之间时，目的产物的竞争优势更加明显；较低的退火温度能有效地增加目的产物的产量，同时使非特异性的扩增降到最低。
3. 应用：适合用于避免非特异性PCR产物出现的实验（PS：尤其是当使用复杂的基因组DNA模板，非特异性退火易发生时）。

四、直接PCR（Direct PCR）

1. 原理：同常规PCR工作原理相似，区别在于所使用的定制缓冲液，其样本可不经过核酸抽提，直接进行PCR反应，但对于参与直接PCR反应的酶的耐受性和buffer的兼容性有相对应的要求。
2. 特点：具有高度耐受的聚合酶，可直接对样本中的核酸分子进行检测。
3. 应用：常用于基因分型、转基因、质粒检测、基因敲除分析、DNA来源鉴定、物种鉴定、SNP分析等研究领域。

五、快速PCR（Fast PCR）

1. 原理：基于普通PCR的工作原理，在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增。
2. 特点：通过缩减PCR步骤所需时间来完成更快的扩增，且不会影响扩增产量和效率。
3. 应用：用于提高临床病例样本检测及诊断的效率、疾控现场应急操作等。

六、定量PCR（Quantitative PCR）

1. 原理：以一种标准作对照，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量进行定量的技术。根据原理的不同，目前主要采用的定量PCR方法包括极限稀释法、设立内参照物的定量PCR、荧光定量PCR（FQPCR）。
2. 特点：具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优势。
3. 应用：目前广泛应用于医学检测、药物疗效考核、基因表达研究、转基因研究、基因检测、病原体检测、动植物检测、食品检测等各种领域。

七、反向PCR（Inverse PCR）

1. 原理：将侧翼区DNA转变成为引物内围区域，用合适的限制性内切酶在已知DNA序列之外切割，再将形成的限制性DNA片段连接成环状分子。所用引物与已知序列两端顺序同源，3’端方向为侧翼区未知DNA序列。经PCR扩增之后，其产物就是该环状分子中未知序列的DNA片段。
2. 特点：必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段，而这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。
3. 应用：目前广泛应用于快速的等位基因分型，以及确定整合到基因组中的反转录病毒、转基因及转座子定位。

八、多重PCR（Multiplex-PCR）

1. 原理：同常规PCR工作原理相似，区别在于多重PCR反应体系加入一对以上引物，各对引物分别结合在模板相对应部位，最终扩增出一条以上目的DNA片段。
2. 特点：可以通过优化反应体系和反应条件提高扩增的片段数量；在引物和反应条件的设计方面也有很大的灵活性，具有单个PCR的特异性和敏感性。
3. 应用：目前广泛应用于包括核酸诊断在内的诸多领域。

九、长片段PCR（Long PCR）

1. 原理：同用两种DNA聚合酶进行反应，一种是用耐热DNA聚合酶（常用Taq酶），以其较强的延伸能力进行链的延伸。另一种是具有3'→5'核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶（常用Pfu酶），以其较好的校读功能，将错配的碱基切割下来重新利用第一种酶进行链的延伸。
2. 特点：随着高合成能力、高保真DNA聚合酶的发明，长片段PCR现在可在短时间内高准确性地完成；通过与一个强DNA结合蛋白的结合，聚合酶可获得高扩增能力，可在短时间内扩增长片段（如>20 kb gDNA片段）；极高保真度（如>100xTag）可确保长片段扩增的低错误率。
3. 应用：常用于长片段DNA的克隆、基因组研究、基因突变等。

十、高（G+C）含量PCR（GC-rich PCR）

1. 原理：高（G+C）含量DNA模板形成的二级和三级结构，在高温环境中呈现变性或不完全变性状态。为了不使变性的DNA在低温下再次恢复复杂结构，将整个PCR扩增过程包括变性、退火和延伸都处于高温条件，使用高Tm值引物和耐高温的DNA聚合酶，扩增高（G+C）含量DNA模板。
2. 特点：高合成能力的DNA聚合酶由于与模板的结合能力更强，有利于完成高GC含量PCR；超高热稳定性DNA聚合酶也有利于高GC含量PCR，因为较高的变性温度（如使用98℃代替95℃）可能会促进双链解离和PCR扩增。
3. 应用：常用于高（G+C）含量基因或DNA片段的扩增、检测低丰度高（G+C）含量DNA序列、高（G+C）含量 DNA片段序列分析等。