白术时珍 | 促进肿瘤细胞抗原呈递可增强结直肠癌对免疫检查点抑制剂的应答

白术时珍 | 促进肿瘤细胞抗原呈递可增强结直肠癌对免疫检查点抑制剂的应答

多年来，中草药在治疗效果、耐受性和安全性方面积累了大量的临床经验。然而，传统复方中草药治疗通过复杂的成分而不是具有已知化学结构和靶点的单个化合物来实现的。在大多数情况下，尚不清楚哪种活性化合物具有治疗活性。

2021年，上海中医药大学附属龙华医院、上海中医药大学中药学院以及印第安纳大学科研团队在《Journal of Clinical Investigation》(IF 15.9)上发表了中医药活性成分联合肿瘤免疫治疗的研究成果“Atractylenolide I enhances responsiveness to immune checkpoint blockade therapy by activating tumor antigen presentation”[1]，该研究筛选发现中药白术的活性成分白术内酯I(ATT-Ⅰ)能显著促进人和小鼠结直肠癌(CRC)肿瘤细胞中MHC-Ⅰ介导的肿瘤细胞抗原呈递，促进CD8+ T细胞介导的细胞毒性作用，从而极大增强免疫检查点阻断治疗的疗效。

中药简介

白术(Atractylodes macrocephalaKoidz.)是菊科苍术属多年生草本植物。地下根较为粗大，略呈拳状，外表灰黄色；茎直立，无毛，中下部茎生有叶片，倒披针形、长椭圆形或椭圆形；叶纸质，两面绿色；头状花序单独生长在茎枝顶端，小花紫红色；瘦果倒圆锥状，密集地覆盖着一层白色长直毛，冠毛刚毛为羽毛状，污白色。花果期8—10月。

研究思路

基于小鼠模型、类器官模型和单细胞测序等完整呈现了提高CD8+ T细胞体外杀伤结直肠癌细胞的中草药小分子化合物筛选、靶点与作用机制识别、治疗响应分析的全流程，发现肿瘤细胞的免疫反应降低和免疫逃避是肿瘤免疫治疗的主要障碍，ATT-Ⅰ治疗可使结直肠癌肿瘤对免疫检查点阻断治疗增敏。为解析中药活性成分抗肿瘤作用机制提供了参考，为中医药在肿瘤治疗领域的研究应用起到了积极的推动作用。

研究结果

1.小分子化合物白术内酯Ⅰ(ATT-Ⅰ)促进CD8+ T细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用

为了鉴定能够提高CD8+ T细胞体外杀伤结直肠癌细胞的小分子化合物，作者首先从500多种广泛用于中药的草药植物中纯化构建了一个包含594个小分子化合物的文库。其次，通过细胞毒性实验排除了与化疗药物相似的高细胞毒活性的化合物。之后，鉴于OT-ⅠCD8+ T细胞能够识别MHC-Ⅰ限制性OVA257-264肽，作者采用稳定表达全长鸡卵白蛋白(OVA)的小鼠结直肠肿瘤MC38细胞系与从OT-Ⅰ小鼠脾脏中富集的CD8+ T细胞共培养，通过筛选与后续分析，确认了白术内酯Ⅰ(ATT-Ⅰ)的有效活性最佳。

图1 ATT-Ⅰ可提高CD8+ T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率

为了进一步证实ATT-Ⅰ的活性，作者从MC38-OVA肿瘤中提取构建了3D肿瘤类器官，并将其与OT-ⅠCD8+ T细胞共培养。与对照相比，经ATT-Ⅰ治疗后，OT-ⅠCD8+ T细胞对肿瘤类器官的杀伤的能力明显增强。

图2 ATT-Ⅰ增强MC38肿瘤源性类器官中的抗原特异性T细胞反应

2.ATT-Ⅰ与免疫蛋白酶体组分PSMD4相互作用

ATT-Ⅰ是从中药白术根茎中分离得到的主要生物活性成分之一，其分子靶点和相关作用机制先前研究尚未确定。作者使用对照和经ATT-Ⅰ处理的MC38肿瘤细胞，通过质谱对细胞裂解液中可溶性的蛋白进行定量、筛选等步骤，证实了PSMD4是ATT-Ⅰ的主要靶蛋白。PSMD4编码蛋白酶体26S亚基非ATP酶4 ，作为泛素(Ub)受体介导泛素化蛋白的募集以进行抗原降解和加工，是处理MHC-Ⅰ相关抗原肽的26S免疫蛋白酶体复合物中的19S调节盖的重要组成部分。结直肠癌细胞的Western blotting实验证实，经ATT-Ⅰ处理后，PSMD4蛋白稳定性增强。为了证实ATT-Ⅰ与PSMD4的直接相互作用，作者纯化了细菌表达的小鼠PSMD4，并在不同浓度下与ATT-Ⅰ在微尺度热泳结合实验(MST)中孵育。结果表明，ATT-Ⅰ对PSMD4具有明显的高亲和力。

图3 PSMD4被鉴定为免疫蛋白酶体中ATT-Ⅰ的分子靶标

3.ATT-Ⅰ以PSMD4依赖的方式促进免疫蛋白酶体的活性

免疫蛋白酶体中的19S调控帽是识别和展开多泛素化蛋白所必需的。19S由ATPase (RPT)和非ATPase (RPN)亚基组成，包括PSMD4。通过结构分析预测了ATT-Ⅰ与PSMD4的潜在结合位点、共价及非共价结合作用。为了分析ATT-Ⅰ对免疫蛋白酶体活性的影响，作者评估了ATT-Ⅰ处理或不处理的MC38细胞裂解物上的chymotrypsin-like(凝乳胰蛋白酶样)、trypsin-like(胰蛋白酶样)和 caspase-like(半胱天冬酶样)活性。将Ac-ANW-AMC (chymotrypsin底物)、Ac-PAL-AMC (trypsin底物)和Ac-KQL-AMC (caspase底物)与细胞裂解物共同培养，通过释放的AMC荧光测定其裂解活性。ATT-Ⅰ处理显著提高了免疫蛋白酶体处理这三种底物的活性。然而，细胞中PSMD4的敲低消除了ATT-Ⅰ的作用，表明ATT-Ⅰ对免疫蛋白酶体的活性依赖于PSMD4。此外，作者还额外分析了PSMD4和PSMD7的空间邻近性和互作，表明ATT-Ⅰ是通过与PSMD4的互作增强了免疫蛋白酶体活性。

图4 ATT-Ⅰ结合PSMD4并稳定PSMD4与PSMD7间的互作，导致蛋白酶体活性增强

4.ATT-Ⅰ促进抗原呈递，提高CRC免疫治疗的疗效

增强的免疫蛋白酶体活性最终可以促进抗原在肿瘤细胞上的加工和递呈，而肿瘤抗原向CD8+ T细胞的递呈是由MHC I类复合体介导的。ATT-Ⅰ处理的小鼠和人肿瘤细胞均显示细胞表面MHC-I 水平升高，表明ATT-Ⅰ处理后肿瘤细胞抗原呈递增加。为了证实细胞毒性的调节是由MHC-I/TCR相互作用引起的，作者使用MHC-I (H2)抗体阻断MHC-I/TCR相互作用后，测试了ATT-Ⅰ对MC38 OVA+细胞毒性的影响。阻断MHC-I/TCR相互作用后，与同型对照组相比，细胞毒性作用降低，且ATT-Ⅰ对肿瘤细胞杀伤的作用几乎被消除。当PSMD4或PSMD7敲除后ATT-Ⅰ处理对细胞抗原呈递增强的影响被消除。

图5 ATT-Ⅰ增强抗原在肿瘤细胞上的呈递

MC38衍生的高微卫星不稳定性(MSI-H)结直肠癌肿瘤对抗PD-1治疗的应答较好，而CT26衍生的微卫星稳定(MSS)结直肠癌肿瘤对抗PD-1治疗响应较低。作者评估了在CRC肿瘤MC38和CT26衍生的C57BL/6和BALB/c小鼠对PD-1与ATT-Ⅰ (50 mg/kg)联合治疗的治疗反应。在PD-1阻断治疗中添加ATT-Ⅰ导致了明显的肿瘤生长控制，而单独使用ATT-Ⅰ治疗效果不明显。因此，无论MSI-H和MSS肿瘤细胞中肿瘤新抗原的含量如何，ATT-Ⅰ治疗均可促进肿瘤细胞的整体抗原呈递。

在原位MC38肿瘤模型中，作者进一步验证了ATT-Ⅰ联合PD-1阻断的治疗效果增强并且试验剂量的ATT-Ⅰ治疗在体内没有明显的毒性。为了确定ATT-Ⅰ特异性靶向PSMD4是否能增强PD-1阻断的治疗效果，作者用抗PD-1或抗PD-1联合ATT-Ⅰ治疗MC38 -PSMD4缺失肿瘤小鼠。ATT-I在联合治疗中的额外获益完全消失，从而证实了ATT-I通过靶向PSMD4的特异性作用。

图6 ATT-Ⅰ增强免疫检查点抑制剂的免疫应答

5.ATT-Ⅰ增强CRC免疫治疗中CD8+ T细胞浸润和细胞毒性

为了确定ATT-Ⅰ治疗对结直肠癌肿瘤免疫变化的影响，作者在原位盲肠壁植入MC38细胞28天后采集结直肠肿瘤，使用细胞计数法(CyTOF)分析肿瘤微环境。与上述肿瘤生长研究类似，ATT-Ⅰ治疗显著增强了PD-1 mAb治疗的抗肿瘤作用。与单药PD-1 mAb或ATT-Ⅰ治疗相比，PD-1 mAb与ATT-Ⅰ联合治疗可显著增强T细胞浸润，减少巨噬细胞浸润。进一步分析显示，ATT-Ⅰ与抗PD-1联合使用后，CD8+和CD4+ T细胞的CD69表达水平均降低。为了确定负责ATT-Ⅰ抗肿瘤作用的免疫细胞群，作者在肿瘤接种前腹腔注射消耗抗体，耗尽小鼠的B细胞、CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。在CD8+ T细胞耗竭后，ATT-Ⅰ与PD-1单抗联合的抗肿瘤作用完全失效。相比之下，CD4+ T细胞的消耗没有显著的影响，而B细胞的消耗只会轻微地降低抗肿瘤作用。

图7 ATT-Ⅰ增强肿瘤浸润淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤活性

由于ATT-Ⅰ的主要作用是通过CD8+ T细胞介导的，接下来，作者对对照组、ATT-Ⅰ、PD-1单抗或ATT-Ⅰ+ PD-1单抗处理的小鼠结直肠肿瘤样本进行了单细胞转录组测序(scRNA-seq)分析，以进一步评估每种条件下CD8+ T细胞的功能。在scRNA-seq数据的t-SNE图分析中，通过其基因表达特征评估肿瘤中的细胞类型。作者测定了每种治疗下肿瘤中T细胞活化(Cd8a、Icos、Cd28、Cd44和Cd69)和细胞毒性(Ifng、Prf1、Pdcd1和Sla2)基因的表达水平。作者的数据总体上证实了ATT-Ⅰ和PD-1单抗联合治疗的活化和细胞毒性增强。联合治疗组细胞毒性水平显示高细胞毒性CD8+ T细胞显著增加。这些数据证实了CD8+ T细胞在ATT-Ⅰ和PD-1单抗治疗后的抗肿瘤免疫反应中的关键作用。

图8 ATT-Ⅰ联合免疫检查点抑制剂治疗小鼠结直肠肿瘤的单细胞RNA-seq分析

作者进一步使用了来自新切除肿瘤组织的8个患者源性肿瘤类器官(PDOs)，以确定用ATT-Ⅰ处理肿瘤类器官是否会影响来自同一肿瘤组织的自体CD8+ T细胞的细胞毒性。肿瘤解离后，将肿瘤细胞与贴壁基质细胞混合形成PDOs。当类器官直径达到100 μm时，将其与肿瘤组织中分离的预激活的自体CD8+ T细胞共培养。作者对球体解离和T细胞毒性进行了评估。正如预期的那样，与对照PDOs相比，ATT-Ⅰ处理的PDOs更容易受到CD8+ T细胞杀伤，这表明类器官解离和肿瘤细胞死亡水平明显较高。

图9 ATT-Ⅰ增强CRC患者源性肿瘤类器官的自体T细胞反应

结论

该研究探索了利用ATT-Ⅰ增强PD-1检查点免疫疗法治疗效果的优势，ATT-Ⅰ是一种靶向免疫蛋白酶体编码基因PSMD4的小分子。ATT-Ⅰ结合可能通过干扰PSMD4-PSMD7相互作用而显著提高26S免疫蛋白酶体的蛋白酶活性。ATT-Ⅰ可能主要促进肿瘤细胞的抗原呈递及其与T细胞的相互作用。ATT-Ⅰ与PD-1抑制剂联合使用可显著增强免疫检查点阻断的治疗效。

参考文献

[1] Xu H, et al., Atractylenolide I enhances responsiveness to immune checkpoint blockade therapy by activating tumor antigen presentation. J Clin Invest. 2021 May 17;131(10):e146832.

本文原文来自PharmCube