限制性内切酶的历史——NEB持续在限制性内切酶领域进行技术创新的跨越之路

限制性内切酶的历史——NEB持续在限制性内切酶领域进行技术创新的跨越之路

限制性内切酶是分子生物学领域中一种至关重要的工具酶，被誉为DNA剪刀。它能够特异性地识别并切割DNA序列，与用于扩增和连接核酸的酶一起，推动了DNA重组技术和现代分子生物学技术的发展。经过半个多世纪的研究，限制性内切酶的应用已经从最初的DNA克隆和基因图谱绘制，扩展到表观遗传修饰识别、高通量文库组装等多个领域。本文将带你回顾限制性内切酶的发现历程及其在不同领域的应用，并重点介绍New England Biolabs (NEB)在这一领域的重要贡献。

限制性内切酶的发现

限制性内切酶的发现最早可以追溯到20世纪50年代初期，当时科学家们发现细菌具有抵抗噬菌体感染的能力。1965年，Arber在一篇开创性论文中提出，限制-修饰系统在细菌抵御入侵噬菌体中发挥着重要作用，并假设这些酶能够结合在特定的DNA序列上。1968年，Meselson等人成功纯化并表征了第一个I型限制性内切酶EcoKI。1970年，Smith从流感嗜血杆菌中分离出能够在特定位点识别和切割DNA的II型限制性内切酶，为该酶的广泛应用奠定了基础。

限制性内切酶的应用

应用于DNA图谱分析

1971年，Daniel Nathans通过使用限制性内切酶切割猿猴病毒SV40的基因组DNA，制作了第一个限制性酶切图谱，开启了分子生物学的新篇章。1975年前后，Southern blot和限制性片段长度多态性（RFLP）两大突破性技术的提出，对DNA图谱分析领域产生了深远影响。1995年，在RFLP技术与PCR技术的基础上发展起来的扩增片段长度多态性（AFLP）技术被报道用于DNA图谱分析。

应用于经典克隆法

1973年，Cohen等人将EcoRI酶切生成的片段连接构建的质粒转入经过适当处理的大肠杆菌中，并证明该质粒是具有生物功能的复制子，开启了重组DNA技术的历史。1990年后，为了解决分子克隆过程中没有足够的插入片段与载体连接的问题，科学家们成功建立将PCR技术结合酶切连接的克隆方法并沿用至今。

应用于甲基化分析

1997年，以AFLP技术为基础发展起来的甲基化敏感的扩增多态性（MSAP）技术建立，用于DNA的甲基化分析。

应用于DNA文库构建

1995年提出的基因表达系列分析（SAGE）技术能同时对上千个转录本进行快速分析，限制性内切酶在其中的标签产生等方面起到关键作用。此外，限制性内切酶也被用于靶标富集（如发夹接头连接）、测序基因分型（GBS）等技术中。

应用于基因编辑

在基因组编辑的起步阶段，限制性内切酶和归位内切酶是在高等生物基因组的非特定位置产生双链断裂以进行转基因的唯一可用工具。

应用于Golden Gate组装技术

2008年，一种基于IIS型限制性内切酶的Golden Gate组装克隆方法问世，只需5分钟，即可在一管中一步获得近100%正确的重组质粒。2018年，NEB发布了Golden Gate组装（GGA）数据优化设计的规则和工具，可在一次反应中实现25+片段组装。2022年，NEB发布了通过52个片段Golden Gate组装构建40kb噬菌体基因组，其理念和流程可用于快速完成很多复杂的大DNA组装构建。

应用于染色质空间结构研究

2002年，染色体构象捕获（3C）技术被推出用于染色质空间结构研究，开启了限制性内切酶的新应用方向。

应用于实时DNA扩增和检测

2007年，基于切刻内切酶进行核酸检测的NESA方法被报道，开启了使用切刻酶进行实时DNA扩增和检测的大门。

应用于开放染色质分析

2017年，来自NEB的Ponnaluri等人将切刻酶Nt.CviPII用于建立NicE-seq（切刻酶辅助测序）方法，用于在单核苷酸分辨率水平上进行开放染色质分析。

NEB与限制性内切酶

NEB与限制性内切酶的故事最早开始于NEB创始人Donald Comb与NEB首席科学官/诺奖得主Richard Roberts的历史性合作。彼时商业化限制性内切酶领域一片空白，Richard Roberts试图说服冷泉港实验室商业化限制性内切酶并将收益用于资助基础研究但未果，而Donald Comb刚刚基于相近理念于1974年成立了一家科研试剂公司。之后水到渠成，1975年，NEB成为第一家销售限制性内切酶的公司，并开展限制性内切酶相关的研究与开发项目，进行限制性内切酶的发现、克隆、测序和表征，以及质量提升与生产优化等工作。运行时间最久的生物数据库之一REBASE限制性内切酶数据库在1975年由Richard Roberts创立，后成为该领域的重要资源。

图 1：NEB第一本产品目录，包含18种限制性内切酶

图 2：多位诺贝尔奖获得者庆祝NEB创始人Don Comb退休，其中Werner Arber和Hamilton Smith于1978年因“发现限制性内切酶及其在分子遗传学问题上的应用”而获诺贝尔奖；2004年摄于NEB

NEB在限制性内切酶的发现中所做的贡献

NEB开展了一项伟大的限制性内切酶发现项目并延续至今，截止到2008年的统计，NEB科学家发现了500多种限制性内切酶，这些科学家不仅包括NEB内部科学家，还包括许多来自海外的合作研究人员。上世纪80年代，中国科学院院士强伯勤曾以访问学者的身份在NEB从事核酸及其工具酶相关研究，发现SfiI（首个8碱基识别内切酶）、NotI等五种限制性内切酶。并且NEB还支持了很多国家，包括中国、喀麦隆、越南、尼加拉瓜、乌干达和葡萄牙限制性内切酶实验室的建立。

图 3：强伯勤院士与NEB创始人Dr. Don Comb；1983年摄于NEB

NEB首先开发重组型内切酶并持续提升酶的性能

开发重组型内切酶

为了提高限制性内切酶的产量、降低价格，以及避免污染活性，并提高批次间一致性等目的，NEB首先将DNA重组技术应用于商业化限制性内切酶的生产。第一个在NEB克隆的内切酶是PstI，产量增加了100倍，NEB的酶价格随即下降了20倍，这是一个双赢的结果，开创了一个影响至今的先例！。EcoRI、MspI、HindIII和TaqαI紧随其后。随着该领域研究人员数量的增加，BamHI、FokI和BglII以及重要且有用的8碱基切割酶SfiI、NotI和PacI也被成功克隆。到目前为止，已经有不少于265个种限制性内切酶被成功克隆表达并商业化。

提升酶的性能

NEB进行了很多创新性的基因工程改造工作来改良内切酶的性能，其中一项非常有意义的改造是选择性切割一条链的切刻酶。2001年，NEB首先创造性地通过结构域交换的方式制备切刻酶。NEB也是第一家商业化切刻酶的公司。另外，NEB通过离散氨基酸替代的定向改造方式产生多种新的序列特异性。不同类型限制性内切酶的融合表达也带来新的酶特性，例如在其识别序列的两侧进行切割。

高保真（HF®）内切酶的推出

当限制性内切酶在非最适条件下使用时，可能会发生非特异性切割，被称为酶的星号活性。由于通常需要在另一反应（如连接或扩增）后立即进行限制性内切酶酶切或需要同时使用两种酶。在这些情况下，更换缓冲液可能非常耗时，或导致样品损失或产率低，这催生了需要在非最适条件下建立限制性内切酶反应的需求。通过深入研究，NEB的科学家开展了一系列创新工作，开发出一种在非最适条件下表现出最小的或无星号活性的限制性内切酶。这就是于2008年上市的高保真（HF®）限制性内切酶的由来。

作为分子生物学发展历史上的重要书写者，限制性内切酶未来必将与更多激动人心的应用相结合，推动科学历史的进步与发展。而NEB仍然将是这段历史及未来的重要参与者及推动者。

参考文献

1. Bertani, G., and Weigle, J. (1953) J. Bact. 65, 113-121.
2. Luria, S., and Human, M. (1952) J. Bact. 64, 557-569.
3. Arber, W. (1965) Ann. Rev. Microbiol. 19, 365-378.
4. Meselson, M., & Yuan, R. (1968)Nature217(5134), 1110-1114.
5. Smith, H.O. and Wilcox, K.W. (1970)J. Mol. Biol. 51, 379–391.
6. Danna, K. and Nathans, D. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2913–2917.
7. Cohen, S. N., et al. (1973)Proc. Natl. Acad. Sci. 70(11), 3240-3244.
8. Southern, E. M. (1975)J mol biol.98(3), 503-517.
9. Grodzicker, T., et al. (1974, January)In Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology(Vol. 39, pp. 439-446). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
10. Qiang BQ, Schildkraut I. (1984)Nucleic Acids Res.,12(11):4507-16.
11. Jung, V., et al. (1990)Nucleic acids research 18(20), 6156.
12. Vos, P., et al. (1995)Nucleic acids research23(21), 4407-4414.
13. Reyna-López, et al. (1997)Molecular and General Genetics MGG253, 703-710.
14. Xu, Y. , et al. (2001)Proc. Natl. Acad. Sci.98(23), 12990-12995.
15. Dekker J (2002)Science295:1306–1311.
16. Kiesling T., et al. (2007)Nucleic Acids Research35(18):e117.
17. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008)PLoS One3(11):e3647.
18. Ponnaluri VKC, et al. (2017)Genome Biol18: 122.
19. Potapov, V., et al. (2018)ACS Synthetic Biology7, 2665-2674.
20. Pryor, J.M., et al. (2022)ACS Synthetic Biology11, 2036-2042.
21. Velculescu, V. E., et al. (1995)Science, 270(5235), 484-487.
22. Singh, P., et al. (2011)High-Throughput Next Generation Sequencing: Methods and Applications, 267-278.
23. Elshire, R. J., et al. (2011)PloS one, 6(5), e19379.
24. Ishibashi, S., et al. (2012)Xenopus Protocols: Post-Genomic Approaches, 185-203.
25. Wil A. M. Loenen. (2019)COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS.
26. Qiang BQ, Schildkraut I. (1987)Methods Enzymol., 155:15-21.
27. Wilson, G.G. (1988)Gene, 74, 281–289.
28. Morgan, R.D., unpublished results.
29. Zhang, P., et al. (2007)Prot. Engineering, Design and Selection. 20, 497–504.