间充质干细胞球形培养系统方法及应用
间充质干细胞球形培养系统方法及应用
摘要
由于干细胞培养系统在临床应用中的重要性，为了优化培养条件，提高细胞培养效率，研究者们对其进行了广泛的研究。球形培养系统通过促进细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，提供了一个类似体内的物理化学环境，克服了传统单层细胞培养的局限性。在悬浮液培养中，相邻细胞的聚集形成一个球状体，在肿瘤和癌症研究、治疗性移植、药物筛查、临床研究以及有机培养中具有广泛的效用。球形培养方法有悬滴培养、凝胶包埋培养、磁悬浮培养、旋转培养等多种。最近，人们正在努力将球体培养体系应用于药物传递平台和共培养的研究中，并调节分化和多能性。为了研究球状细胞的培养，根据需要，使用各种生物材料作为水凝胶、薄膜、颗粒和珠子的构建形式。然而，球体细胞培养系统在球体核心中存在缺氧和坏死等局限性。
论文介绍
一般来说，传统的二维细胞培养系统，其中细胞作为单层生长，在实现体内多细胞条件方面面临着一些限制。这些局限性限制了涉及多细胞特征和癌细胞的细胞研究。当干细胞在二维培养中生长时，维持分化电位和硬化性相对比在实际多细胞条件下生长的干细胞更困难。然而，三维细胞培养系统可以重构类似于体内微环境中的条件。三维系统构建了细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用网络，它在各种细胞机制中发挥了重要作用，随后维持了细胞特性。
球体培养系统是一种很有前途的三维细胞培养方法。球体培养系统培养的干细胞形态与单层培养系统培养的细胞形态不同。此外，球状体的间充质干细胞通过细胞-细胞外基质的相互作用，维持了其内在的表型特性，促进干细胞标记转录因子，分泌更高水平的细胞因子和趋化因子，影响细胞的增殖、可行性和迁移，也比单层细胞中分泌的干细胞分泌更高的血管生成。由缺氧诱导的基因表达上调调节的球体干细胞具有细胞凋亡抵抗性、生存能力提高、血管生成因子和趋化因子的分泌等特性。
图一 球体形成的方法
（a）球体培养 （b）液体覆盖 （c）悬滴培养 （d）旋转培养 （e）旋转壁式容器 （f）微流控芯片 （g）磁悬浮
球状体形成方法
球粒培养
细胞通过离心力集中到管的底部。通过靠近管底部的单个细胞，使细胞-细胞粘连最大化（图1a）。为了获取细胞球，移除上清液，在培养基中重新悬浮细胞球，估计细胞数后，将培养基中的细胞分配到具有细胞排斥表面的96孔U底板的每孔中。液体覆盖
液体覆盖培养技术，也称为静态悬浮培养，通过中断细胞在非粘附培养板上的粘附而形成球状体（图1b）。非粘附的培养层通常由琼脂或琼脂糖凝胶组成。琼脂糖是一种非常有效的抑制细胞附着的材料，并且在其非附着性方面优于琼脂。由于细胞附着受到抑制，细胞通过促进细胞粘合分子在非粘附表面上自发形成球体。但是琼脂糖在与肿瘤细胞相互作用时有困难，并且无法激活与肿瘤细胞对治疗过程的反应相关的特异性信号通路。近年来，透明质酸可以成为一种合适的替代生物材料，可以替代琼脂糖。它有能力在癌症进展过程中与癌细胞的表面受体相互作用。这种相互作用增强了与增殖、血管生成、生存和分化相关的细胞信号的转导，以及对治疗剂的抗性。悬滴培养
从单层细胞培养开始，然后将细胞制成悬浮液，用培养基稀释，以达到所需的细胞密度。随后，在兼容的多步骤或多通道移液管的帮助下，将细胞悬液分配到微型托盘的孔中。盖子放在微型托盘上，整个微型托盘颠倒过来。附着在微型托盘上的细胞悬液滴将通过表面张力停留在相反的表面上。在这种方法中，由于表面张力和重力的同时作用，球体形成液滴(图1c)。通过控制液滴的体积或细胞悬液的密度，可以控制球状体的大小。新型悬滴阵列平台能够有效地形成一定尺寸的球状体。旋转培养
旋转培养技术是指在旋瓶生物反应器容器中通过搅拌连续混合细胞悬液的技术(图1d)。搅拌棒的对流力影响着容器内流体的状态和质量，是形成球体的关键。高搅拌速率会对球形细胞造成损伤。然而，极其缓慢的搅拌速度会使球形细胞沉到容器底部，从而抑制了容器中球体的形成。旋转壁式容器
旋转壁式容器通过恒定的圆周旋转重建微重力。由于不断旋转，细胞在容器中持续处于悬浮状态(图1e)。微流体
微流控培养技术，也称为芯片上的实验室技术，用于单细胞分析、遗传分析和药物毒性研究等应用。该培养方法具有与体内微结构规模相对应的微尺度尺寸(图1f)。微流控装置易于对环境进行微尺度控制，模拟体内三维环境。微流控方法的特点之一是它集成了多个过程，包括细胞捕获，混合，检测和细胞培养。另一个特点是相当高的细胞通量用于细胞分析。微流控装置采用可渗透氧气的材料和影响增殖的生长因子。微流体技术的这一特性可以减少缺氧，这是球形培养不可避免的缺点。磁悬浮
磁悬浮培养是利用磁颗粒，在给定条件下与水凝胶结合。在磁悬浮系统中，细胞与磁颗粒混合，在细胞培养过程中受到磁力的作用(图1g)。该系统采用负磁泳，可以模拟失重状态，因为正磁泳会阻碍失重的实现。由于磁力的作用，与磁性颗粒结合的细胞悬浮在重力中。这种条件引起细胞体积的几何变化，促进细胞间的接触，导致细胞聚集。此外，该系统可以促进多细胞共培养，不同细胞类型的聚集。
使用生物材料的方法
图二 使用生物材料的方法
水凝胶
水凝胶被广泛用于细胞培养研究。使用生物相容性材料如海藻酸盐、纤维蛋白、胶原和透明质酸制备了水凝胶。水凝胶的主要特性是可以包埋间充质干细胞(图2a)。这种方法有效提高了细胞的活力，同时减少了细胞凋亡。此外，与单层培养的非包埋细胞相比，水凝胶包埋的细胞稳定维持成骨分化潜能，激活促血管生成因子的分泌。生物膜
由生物材料制成的薄膜可以通过各种方法构造，如光刻和冲压（图2b）。肿瘤细胞球体可以在薄膜上培养。通过改变膜材料的组成和浓度，可以增强干细胞的粘附性和增殖。薄膜中使用的成分比对球体的大小、球体的制造速率以及细胞的粘附和增殖都至关重要。在之前的一项研究中，透明质酸(HA)修饰的壳聚糖膜被发现比未修饰的壳聚糖膜形成更大的球状体并诱导细胞聚集。球状体的大小也会受到薄膜厚度的影响。在壳聚糖膜上的培养可以改善血管生成、趋化性和自我更新。最近，人们将石墨烯作为一种细胞培养材料进行了研究，石墨烯被认为能够调节间充质干细胞的神经分化和生长。微粒
颗粒因子控制细胞培养的微环境（图2c）。球体培养的一个缺点是球体核心的营养和氧供应不足。这是由于扩散梯度的增大而增大引起的。然而，球体中的颗粒能够在培养过程中控制球体内部的条件，细胞的存活能力和增殖能力得到提高。
球状体的应用
球形培养系统是研究癌细胞组织结构、信号通路和免疫激活的一种很有前途的方法。使用动物模型的研究在疾病建模中有局限性。目前，采用球状细胞培养可以克服使用小鼠模型进行药物筛选研究的参数。通过提高球体培养期间的均匀性，肿瘤球体可以提供关于疾病的精确信息，并抑制正在开发的药物的不良副作用，球形共培养可用于药物筛选研究。移植是最有前途的再生治疗策略之一。球状体植入后，干细胞可能被诱导分化为适合重建缺损部位的细胞。球状体的分化潜能已在体外得到证实。与单层培养相比，球形培养提高了分化潜能。
总结与评论
干细胞已显示出在各个领域的适用性，如再生医学，肿瘤和癌症研究。三维培养通过提高培养效率，增强了干细胞的适用性。球形培养系统是一种很有吸引力的方法，克服了传统单层培养的局限性。该系统可以解决单层培养在体内实现多细胞微环境受限的问题，可以重建细胞与细胞间、细胞与细胞外基质相互作用的生物信号通路，促进细胞的增殖和生存能力。表型特性得到了改善。总之，球体培养的发展是进一步优化球体的形成并将其作为医学领域的资源的关键。