突破性研究：优化农杆菌载体显著提升植物和真菌基因转化效率

突破性研究：优化农杆菌载体显著提升植物和真菌基因转化效率

加州大学伯克利分校的研究团队最近在植物基因工程领域取得重大突破，通过优化农杆菌介导的转化过程（AMT），成功将植物转化效率提高100%，真菌转化效率提高400%。这一发现不仅能够显著提升植物基因工程的效率，降低成本，还为CRISPR基因编辑技术在植物中的应用提供了新的解决方案。

对植物进行基因改造的能力很大程度上要归功于一个微观的助手：细菌——野生型农杆菌。这种细菌会在开花植物中引起破坏性的肿瘤，包括一些具有重要经济价值的作物，但它插入自身DNA进入宿主植物的能力，不仅使其成为农民的害虫，而且也是生物技术的有力工具。

今天发表在《自然·生物技术》上的一项新研究显示，对农杆菌进行一些简单的改变可以显著提高将DNA引入植物的效率，也称为“转化”，并为转化其他农作物和真菌开辟了新的机遇。这项研究由加州大学伯克利分校创新基因组学研究所（IGI）和联合生物能源研究所（JBEI）的帕特里克·施（Patrick Shih）团队完成。

农杆菌介导的转化过程（AMT）近几十年来已成为植物和真菌生物技术领域越来越广泛使用的工具。

二元载体或质粒的简化图谱，显示研究人员打算插入宿主生物的插入DNA、主干区域和复制起点，这是本研究的重点。

AMT的工作原理

“AMT 在高层次上只是一种将DNA插入目标细胞的工具，”研究第一作者Matthew Szarzanowicz解释说。“在野外，它是一种植物病原体，会将自己的一小段DNA插入到植物体内，从而引起植物中滋生细菌的肿瘤。”

1980年代，研究人员采用并简化了该系统，使植物生物学家能够将DNA引入植物基因组。更复杂的细菌系统被简化为一个小的圆形质粒——一种被称为“二元载体”的载体，被设计用来容纳感兴趣的DNA并将其带入植物细胞。

在过去的几十年里，进行AMT的植物科学家并没有过多考虑二元载体本身的结构：他们使用其他实验室过去使用过的载体，添加自己的DNA，然后希望获得最佳效果。对二元载体的骨架序列关注相对较少。

“我们想问的是：这是一个优化的系统吗？”Szarzanowicz说。“我们强烈地感觉到答案是否定的，因为从来没有人尝试过实际设计它，使其更适合AMT。”

植物转化的局限性

“问题之一是，绝大多数植物实际上无法通过农杆菌进行转化，因此存在多样性问题，”Shih说道。“但即使对于那些可以转化的植物，其转化效果也存在相当大的差异。”

对于生物技术而言，效率至关重要。进行植物转化既耗时又耗资源，而且成本高昂。失败的次数越少，大规模进行就越快，成本就越低。

IGI和JBEI的研究人员对高粱特别感兴趣，因为它可能用于生产高级生物燃料和生物产品以及去除大气中的碳。但高粱并不总是能配合。

“我们可以用农杆菌进行转化，但这需要花费大量的金钱和时间，”施解释说。“但如果你能加快转化植物的过程，并一次性获得更多成果，那么就能节省大量的时间和金钱。”

复制越多，成功越多

二元载体的主链序列包含一个称为复制起点的区域，DNA复制从这里开始，这对于质粒自我复制至关重要。该区域还控制质粒产生的拷贝数，范围从1个拷贝到几百个拷贝。先前的文献表明，更高的拷贝数可能导致更有效的转化。该团队着手研究他们是否可以通过设计具有越来越高拷贝数的质粒来控制这一点。

为了验证这一点，该团队研究了AMT中使用的四种不同的复制起点，设计随机突变体，并使用定向进化分析来选择具有更高拷贝数的个体。

“然后我们回过头来找到了所有这些突变，我们发现其中很多突变确实增加了拷贝数。然后我们利用这些质粒作为双元载体，细菌利用该载体将DNA发射到植物基因组中，”Shih说道。

通过增加拷贝数，研究小组证实他们可以提高转化效率，结果比他们预期的还要惊人。他们能够将植物转化效率提高100%，真菌转化效率提高400%，所有这些都是通过在复制起点添加简单的点突变来实现的。

除了提高植物科学家插入基因进入植物，这一发现也具有重要意义CRISPR基因编辑在植物中。

“最大的问题之一就是CRISPR试剂的递送，这不仅在植物中如此，在我们想要编辑的其他生物中也是如此，”Shih解释道。“你引入CRISPR-Cas9，你进行了编辑并删除了它，所以它不是转基因，你首先还是得能把它递送到细胞中。大多数时候，我们用农杆菌来做到这一点，所以问题是我们如何更有效地递送Cas9试剂来进行编辑？”

Shih和Szarzanowicz希望这项研究能够实现对转化的更精细控制，从而缓解植物和真菌工程中的一个关键瓶颈。

Szarzanowicz表示：“希望植物科学家能够研究这个问题，并说，也许我们在尝试优化这些系统时应该考虑更多，也许我们现在可以使用这套工具开始在其他物种身上进行尝试，看看哪种方法最有效。”

年轻拟南芥来自同一转化实验的植物表达红色报告色素，表明转化结果可能存在差异。提高转化效率和对结果的控制可以极大地帮助现实世界的植物生物技术应用。（照片：Matthew Szarzanowicz）

Shih感兴趣的是这种方法将如何影响真菌应用以及植物。

“农杆菌还没有进化到可以转化真菌的程度，但这是可以实现的，所以我们可以改进这个过程，”Shih说。“现在我们有了这个框架，可以尝试更好地转化许多与工业无关的真菌，这些真菌与制药公司和用真菌制造生物材料的公司等不同行业息息相关。”

这项研究的主要作者包括Matthew J. Szarzanowicz、Lucas M. Waldburger、Michael Busche等。研究得到了美国能源部联合生物能源研究所的资助。