外显子测序（WES）：原理、流程与应用

外显子测序（WES）：原理、流程与应用

外显子测序（Whole-Exome Sequencing，WES）是一种针对基因组中所有外显子进行测序的方法。外显子是基因组中能够转录出成熟RNA的部分，虽然仅占人类基因组的1%，但却包含了85%与疾病相关的变异。因此，WES在研究编码基因变异层面，是比全基因组测序更为经济高效的替代方法。

基本概念

• 外显子（Exon）：基因组中能够转录出成熟RNA的部分。一个基因组中所有外显子的集合，即为外显子组。值得注意的是，通常所说的全外显子组测序，是指针对蛋白编码基因的外显子，很少涉及非编码基因。

• 基因（Gene）：DNA中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制生物性状的基本遗传单位。人类基因区间的大小可从数百个bp至超过200万个bp不等。根据人类基因组计划（The Human Genome Project）估计，人类拥有20000-25000个蛋白编码基因。

• 基因组（Genome）：指一个生物体所包含DNA的全部遗传信息。基因组由基因区域和非编码区域组成。人类的基因组大小约为30亿个碱基对（bp）（3GB），其中非编码区域占到绝大多数，编码蛋白质的区域仅占约2%左右。

• 外显子组（Exome）：是基因组中所有外显子的集合。人类拥有约18万个外显子，约占人类基因组的1%，即约3000万个bp（30MB）。

特殊情况：非翻译区（UTR）

在mRNA的两侧分别存在5'UTR（前导序列）和3'UTR（尾部序列），它们的作用分别是调控翻译的启动和终止。它们由外显子序列构成，但不会被翻译成氨基酸。所以，并非所有外显子序列都会被翻译成氨基酸。

测序方法对比

• 全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）：对整个基因组进行测序。

• 靶向测序（Targeted-sequencing，也称Panel sequencing）：对选定的基因进行测序，通常有几十个至一千个基因不等。因而，从覆盖基因组的范围来说，全基因组测序>全外显子组测序>靶向测序。

全外测序可以视作一种特殊的靶向测序——它靶向的区域是基因组上的所有外显子。panel测序有两种技术原理：杂交捕获测序和多重扩增子测序。全外是基于序列杂交原理实现的。

应用场景

需要特别说明的是对CNV的检测。使用全外检测CNV时，在杂交捕获过程中，由于各个外显子的杂交效率不同，故不同外显子的覆盖率差异会较大。当出现阳性结果时，无法判断是由于杂交未捕获到，还是由于缺失。 故使用全外检测CNV容易出现假阳性结果。一般情况下，全外测序不用于CNV的检测 ，但在癌症研究中，利用癌组织和癌旁组织对照，可以检测体细胞CNV。

人类全外显子组所占基因组比例不超过2%，但它包含了约85%与疾病相关的变异，因此在研究编码基因变异层面，全外测序是比全基因组测序更为经济高效的替代方法。全外测序适用于孟德尔疾病、肿瘤、复杂疾病等多个研究领域。对于表现出异质性的疾病，或者患者表现出多个系统受累的复杂疾病症状时，尤为适合使用全外测序。

例如在肿瘤临床检测中，寻求肺癌靶向治疗的患者通常会先做panel测序，因为与肺癌靶向治疗相关的基因是比较明确的，几十至一百多个基因的panel测序通常就可以满足需求。而对于寻求免疫治疗的患者，通常会使用全外或大panel测序，来评估肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden, TMB），TMB高的患者通常对免疫治疗有更好的响应。全外测序是业内公认的评估TMB的金标准。

WES检测流程

一个WES测序的工作流程，大体可以分为这3个部分：文库制备，测序，生信分析。

• 文库制备：通常包含这些步骤：样本处理，DNA提取，定量，建库，杂交捕获，扩增，质控。

• 测序：目前的仪器包括国外Illumina公司测序平台，以及华大智造国产测序平台等。

• 生信分析：流程通常包含这些步骤：质控，拼接比对，去重和重排，变异检测，降噪和过滤，注释等。常用的软件有FastQC，BWA，GATK，ANNOVAR等。

一个完整的全外显子组测序，从样本处理到完成数据分析，通常需要10天左右时间。