新手指南：如何设计CRISPR实验进行基因组编辑

新手指南：如何设计CRISPR实验进行基因组编辑

CRISPR基因组编辑工具原理是什么？表达系统如何选？如何设计gRNA？若你不知从何下手，今天，我们为大家一一梳理CRISPR实验指南。

简介

CRISPR和CRISPR关联系统(CAs)是强大的基因编辑技术。最初被发现是在细菌体内特有的，内源CRISPR系统以RNA依赖的防御机制抵抗外来噬菌体DNA的入侵。细菌和古菌进化的自适应免疫防御，称为群集定期空隙短期复发性重复(CRISPR)/CRISPR关联(CAs)系统，使用短RNA可以直接降解外源核酸。

2013年，CRISPRcas9基因组编辑以其能使目标DNA双链断裂的能力被开发利用,是分子生物学中革命性的进展。本文涉及CRISPR实验设计的基础知识。

CRISPR的基本原理说明

2012年，Makarova等人将内源的CRISPR系统分为三类:I型、II型和III型。由内生型II系统改编和简化的CRISPR基因组编辑工具主要有以下组件构成:

1. Cas9: 核酸内切酶,其作用是诱导基因组DNA双链断裂,允许基因或DNA序列的移除,以及在特定位点外源DNA的整合。
2. 向导RNA(gRNA): 这种RNA具有一段特殊序列，是Cas9结合所必须的,以及一个20个核苷酸的自定义间隔序列。
3. 同源重组模板(可选): 这是一个包含突变的DNA片段,用于引入同源区域。

CRISPR/Cas9基因编辑是如何进行的?

1. 在同一细胞中表达gRNA和Cas9,形成gRNA:Cas9复合物以招募目标DNA序列,其位于上游的一个前间区序列邻近基序(PAM)，大多数Cas9酶识别PAM基序是依赖于NGG序列（一个任意核苷酸之后带有2个鸟嘌呤核苷酸)。
2. gRNA与目标DNA的结合是通过互补碱基配对原则，基因组目的序列和gRNA上的20个核苷酸的间隔区识别。随后gRNA：Cas复合物上的Cas9酶切断基因组DNA，导致PAM序列后的DNA双链断裂。至关重要的是，Cas9不能消化DNA，除非DNA结合到gRNA上，因此具有系统特异性。
3. 最后，通过内源非同源性末端接合(NHEJ)途径修复断裂，至此编辑过程完成。虽然这种DNA修复系统是最有效的修复途径,但也容易出错,有时会有小的插入或删除,会导致移码，降低蛋白质产量。另一种选择是利用内生同源性定向修复(HDR)系统，通过提供同源重组模板,通常在需要引入目标突变时使用。

目标序列和gRNA注意事项:

1. 在设计gRNA之前,确定你的目标DNA的精确序列，如果gRNA和目标DNA不同，则会降低效率。同时，检查是否有物种特异性，细胞专一性，多态性。
2. 接下来，确定所有PAM序列(NGG)在你的兴趣区域内。一旦确定，你可以在最佳的潜在目标区域进行选择。
3. 基于PAM的位置设计gRNA和HR模板(如果使用)。gRNA必须匹配目标DNA,同样重要的是,gRNA不应该与任何其他的远离目标序列的基因组位点匹配。HR模板设计好之后克隆进载体中

CRISPR结构的转染和筛选

设计好gRNA和HR模板后,将Cas9质粒和gRNA及HR载体共转染至已选择好的细胞株中，可以使用脂质转染、电穿孔或显微注射等转染方法。

转染后,下一步即为筛选，可以通过限制片段长度多态性分析(RFLP),TIDE分析，测序技术或荧光激活细胞分选(流式细胞术)等方法进行。最优的筛选方法取决于你所做的修饰和所选细胞系。

Tips

• 最终，CRISPR基因组编辑实验的效率好坏，一部分在于计划，一部分在于运气。系统组件和Cas9的相互作用机制还不是很清楚。
• 使用高质量的完整DNA，确保没有RNA和其他污染物。
• 检查HR模板与Cas9/PAM的结合位点，这些位点有可能会导致模板降解。
• 对PAM位点进行筛选，通过沉默突变移除它们。
• NGG替换为NAG是不起作用的，NAG是一个隐藏的PAM位点。