纳米超声造影剂用于协同化学光热疗法和增强免疫疗法治疗肝癌及转移

纳米超声造影剂用于协同化学光热疗法和增强免疫疗法治疗肝癌及转移

晚期肝癌是最致命的恶性肿瘤，由于肿瘤的复杂性和异质性，临床治疗效果并不十分理想。联合治疗可以通过刺激多条途径，调节肿瘤免疫微环境，有效地提高肿瘤的治疗效果。纳米给药系统已经成为肝癌治疗联合策略的有吸引力的候选者。本研究报告了一种纳米超声造影剂(三氧化二砷(ATO)/PFH NPs@Au-cRGD)，将诊断和治疗集成在一起，以实现有效的超声成像和肝癌治疗。这种纳米递送系统通过ATO诱导的铁下垂和光热诱导的免疫原性细胞死亡来促进肿瘤相关抗原的释放，从而增强ATO和光热治疗在人Huh7和小鼠Hepa1-6细胞中的协同效应。该给药系统成功地激活了抗肿瘤免疫反应，促进了肿瘤微环境中巨噬细胞M1的极化，对皮下和原位肝癌的副作用较小。此外，当纳米粒递送系统与抗程序性死亡配体1(PD-L1)免疫治疗相结合时，原位肝癌的肿瘤转移受到抑制，并建立了长期免疫记忆。这种安全的纳米给药系统可以加强抗肿瘤治疗，抑制肺转移，并实现治疗效果的可视化评估，为肝癌的临床应用提供了巨大的潜力。

图1ATO/PFH NPs@Au-cRGD在超声和光热辅助下治疗肝癌及转移的示意图

ATO通过GSH耗竭和GPX4升高诱导肿瘤细胞铁死亡；而升高的ROS也可以直接杀死肿瘤细胞，从而增强协同作用。铁死亡和光热效应进一步促进TME中未成熟DC转化为成熟DC和巨噬细胞M1极化，进而激活天然T细胞成为细胞毒性T淋巴细胞，从而抑制肿瘤生长。抗PD-L1 mAb通过阻断PD-1/PD-L1轴进一步促进细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤作用，从而实现对原位肝癌的协同治疗，并增强免疫反应，从而减少肺转移。

纳米粒子的物理化学特性、体外和体内超声成像功效以及光热能力

DSPE-PEG2K是一种生物相容性、可降解的两亲性材料，可以延长血液循环时间、提高稳定性和包封率。因此，作者以DSPE-PEG2K为骨架，构建适体功能化的核壳纳米粒子，以ATO和PFH为核心，以AuNPs为外壳。DSPE-PEG2k-SH、DOTAP、DPPC和胆固醇形成脂质膜负载ATO和PFH，合成ATO/PFH NPs。 然后，RGD-SH 通过 SH 键与金壳结合。透射电子显微镜 (TEM) 证实了 AuNPs 沉积在脂质体表面（图 2A）。水溶液中的流体动力学直径为 121 ± 5 nm，Zeta 电位为 10.47 ± 1.20 mV（图 2B）。浓度分析表明，ATO/PFH NPs@Au-cRGD 的尺寸范围约为 100-150 nm（图 2C）。在磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 和血清 (5%, pH 7.4) 中于 4、25 和 37 °C 储存 7 天后，粒径和 Zeta 电位没有明显变化，表明合成的纳米粒子具有良好的稳定性 (图 2D、E)。紫外可见光谱结果表明，ATO/PFH NPs@Au-cRGD 在 760 nm 处具有特征性的等离子体耦合（AuNPs 之间）吸收峰，而在未包被的脂质体中未检测到近红外波长处的共振峰（图 2F）。为了评估纳米药物递送系统的控释能力，检测了ATO在pH 7.4和6.5下的药物释放特性（pH 6.5用于模拟弱酸性TME）。药物释放曲线如图2G所示，与游离ATO的快速释放（24小时内释放约92%）相比，ATO NPs-cRGD表现出明显的缓释性。具体而言，在pH 6.5的UTMD作用下，ATO NPs-cRGD在7天时释放率高达85.3%±0.4%，但在12小时时释放率约为62.4%±0.4%。此外，在超声治疗仪和低酸性TME（pH 6.5）的帮助下，ATO可以有效释放。为了评估ATO/PFH NPs@Au-cRGD的超声成像能力，以生理盐水为阴性对照，以SonoVue造影剂为阳性对照，进行了体内和体外成像实验。如图2H所示，超声暴露后，SonoVue和ATO/PFH NPs@AucRGD的对比增强图像在体外均有明显增强。

细胞摄取和细胞毒性

药物有效的细胞摄取能力是发挥良好抗肿瘤效果的前提，因此作者评估了纳米粒子在Huh7和Hepa1-6细胞的摄取能力。如图3A，B所示，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测发现，在Huh7和Hepa1-6细胞系中，荧光强度为游离Rhod<Rhod NPs@Au<Rhod NPs@Au-cRGD<Rhod NPs@Au-cRGD+UTMD。而流式细胞仪在Huh7和Hepa1-6细胞中的测量结果（图3C，D）与CLSM一致，Rhod NPs-cRGD+UTMD组的细胞内荧光强度最高，说明由于cRGD-SH和UTMD的修饰，纳米粒子的吸收明显增加。 ATO在Huh7和Hepa1-6细胞中的IC50浓度分别为15.71和2.23μm（图3E，F）。为了评估ATO和其他处理对Huh-7和Hepa1-6细胞的影响，进行了CCK8实验。处理24 h后，与游离ATO和其他纳米颗粒组相比，ATO/PFH NPs@Au-cRGD+UTMD+激光组的细胞活性显著降低，在UTMD和激光作用下抗增殖作用最强（p < 0.05；图3G，H）。

ATO/PFH NPs@Au-cRGD诱导铁死亡的机制

随后，作者用不同制剂处理后，评估了Huh7和Hepa1-6细胞系中的GSH水平。在ATO和纳米粒子的干预下，GSH水平显着下降，ATO NPs@AucRGD + UTMD +激光组的GSH水平最低，表明该纳米递送系统可以有效诱导GSH耗竭（图4A）。引入活性氧（ROS）指示剂2′，7′-二氯二氢荧光素，通过测量荧光强度来检测ROS的生成。 经过ATO NPs@Au-cRGD + UTMD +激光处理后，经流式细胞术和荧光强度定量分析测得的ROS在该组中最高（p <0.001）（图4B，C）。免疫荧光图像显示了类似的结果（图4D），揭示了ATO的存在导致ROS水平升高和GSH耗竭。 NPs中释放的ATO是否能够诱导铁死亡获得抗肿瘤作用尚不清楚，因此进行了相关实验。测量了铁死亡相关蛋白GPX4的蛋白表达水平，ATO NPs@AucRGD+UTMD和ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+激光组均显示GPX4表达显著降低（图4E）。CLSM图像显示C11 BODIPY荧光探针显示出类似的LPO增加（图4H）。流式细胞术检测显示，ATO纳米粒子处理后LPO显著增加（图4F、G），可导致肿瘤细胞铁死亡。 不同处理后Huh7和Hepa1-6细胞的Bio-TEM图像显示，该纳米递送系统可导致Huh7和Hepa1-6细胞铁死亡。红色三角标记表示严重氧化损伤后Huh7和Hepa1-6细胞的空泡线粒体，蓝色三角标记表示相对健康的线粒体（图4I）。

ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+laser对Huh7荷瘤小鼠的肿瘤靶向性和抗肿瘤活性

为证实NPs的肿瘤靶向作用，作者通过活体成像研究了NPs在小鼠体内的生物分布。 当肿瘤体积达到200 mm3时，通过尾静脉将游离的Dir、Dir NPs和Dir NPs-RGD注射入小鼠体内。 注射后，利用小动物活体成像系统观察2、4、8、24和48 h的体内荧光分布（图5A）。与Dir和Dir NP组相比，Dir NPs-RGD组在48 h时肿瘤内累积生物发光更高，提示RGD-NPs具有更好的肿瘤靶向能力。48 h后处死各组小鼠，取出小鼠肿瘤及主要器官，进行离体成像。 Dir NP-RGD组肿瘤荧光强度最强（图5B）。NPs-cRGD组药物在肿瘤中的蓄积明显高于在器官中的蓄积。简言之，这些差异表明ATO NPs@Au-cRGD组具有优越的肿瘤靶向能力。小鼠并切取重要器官或肿瘤进行进一步实验。首先从小鼠体内摘除肿瘤的重量可以看出，PBS组小鼠平均肿瘤重量达到1.5g，约为游离ATO组的1.32倍，是ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+激光组的4.78倍（图5H）。ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+激光组的抑瘤效果最好，抑瘤率为79.1%（图5D），且小鼠体重相对稳定，表明该纳米药物载体能有效抑制肿瘤生长，且毒性、副作用小。为了研究ATO的药代动力学特性，测定了不同时间点血液中ATO的剂量。与ATO组相比，ATO NPs@Au和ATO NPs@Au-cRGD的控释表现出显著延长的半衰期、降低的清除率和提高的AUC（表S1，支持信息）。脂质体纳米粒子改善了ATO的药代动力学行为，可能导致药物在肿瘤部位的蓄积增加。此外，生存曲线显示PBS组小鼠均在第26天之前死亡，而ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+laser组小鼠生存时间最长（图5E）。肿瘤HE染色结果显示，纳米药物递送组肿瘤细胞坏死面积明显高于PBS组，提示纳米药物递送治疗组可造成肿瘤细胞死亡(图5I)。

ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+laser引发的体外免疫原性细胞死亡和体内免疫反应

为了探究ATO NPs@Au-cRGD的体内体外免疫反应，进行了流式实验。如图6A 所示，流式细胞术检测到，在不同处理下孵育 24 小时后，CRT 表达显著增加。 通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和生物发光试验测定，ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+laser 也大大增强了 HMGB1 释放（图 6B）和 ATP 分泌（图 6C）。

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是决定免疫治疗疗效的关键，一般分为抗肿瘤的M1型和促肿瘤的M2型。以M1和M2型巨噬细胞的标志物CD86和CD206分别评估不同治疗组M1/M2型巨噬细胞的比例（图6F）。流式细胞术分析显示，ATO NPs@Au-cRGD+UTMD（4.08）和ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+laser（6.33）组的M1/M2比例均显著高于PBS组（1.98），提示ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+laser可有效促进TME中M2型巨噬细胞复极化为M1型巨噬细胞。此外，纳米递送系统显着上调了Huh7肝肿瘤中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-α（IFN-α）的水平（图6D，E），这是肿瘤免疫的重要指标。TNF-α和IFN-α的ELISA结果与上述免疫细胞流式分析结果一致，表明肿瘤内有炎症，肿瘤免疫抑制得到改善。综上所述，证实了ATO NPs@AucRGD+UTMD+激光组可有效重塑免疫抑制性TME，促进免疫杀伤反应。纳米药物递送组和PBS组主要器官的HE图像无明显差异，表明纳米递送系统具有良好的生物相容性和生物安全性（图6G）。

对原位肝肿瘤的抗肿瘤和抗转移作用

随后，作者通过超声成像监测了肝癌原位生长情况（图7A），PBS组肝癌原位生长迅速，抗PD-L1单抗注射液单独使用对肿瘤生长有轻微抑制作用，而联合用药的原位抑瘤率可达82.5%（图7B），抑瘤效果最佳。为了探究ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+激光+抗PD-L1 mAb协同抗肿瘤作用的机制，作者通过流式细胞术、ELISA和Western印迹法分析肿瘤原位免疫细胞，并从小鼠腹股沟引流淋巴结（LN）中提取树突状细胞（DC）作为抗原呈递细胞，进行树突状细胞成熟分析。联合治疗组小鼠淋巴结中 CD11c+CD80+CD86+ 细胞 (43.23% ± 4.43%) 显著高于对照组 (26.63% ± 2.71%)、抗 PDL1 mAb 组 (30.3% ± 2.09%) 和 ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+激光组 (34.3% ± 5.51%；图 7C )，提示联合治疗可有效刺激 DCs 成熟，激活全身免疫活动。 此外，促进细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 杀伤作用的 M1 细胞因子 TNF-α、IFN-γ和IL-12 在联合治疗组中显著高于其他三组 (图 7F)。 T 细胞产生的 IFN-γ进一步降低了xCT 蛋白的分泌，从而增强了该研究的纳米药物递送系统诱导的肿瘤细胞的铁凋亡（图7G）。联合治疗组的 CTL 百分比与抗 PDL1 mAb 治疗组（43.47% ± 5.75%）相比显着增加（63.03% ± 3.84%），这归因于 TAA 释放增加以招募 CTL 到肿瘤部位。 与抗PD-L1 mAb单独治疗相比，联合治疗组的Th细胞（31.37%±1.84%vs 55.33%±4.75%）和DC（30.3%±2.09%vs 43.23%±4.43%）比例也显著增加，而Treg细胞（3.12%±0.13%vs 0.82%±0.05%）减少，提示免疫抑制缓解，免疫反应增强。 联合治疗组的颗粒酶B水平最高，在诱导抗肿瘤和免疫反应方面能发挥最强的作用。这些结果表明联合治疗组产生了更多的反应分子来触发免疫反应并增强抗肿瘤免疫，从而协同增强了抗肿瘤免疫。 HE染色结果显示PBS组和抗PD-L1 mAb组均有明显的肺结节，其中黑色方框代表肺结节，说明抗PD-L1 mAb对抑制肿瘤转移的作用不大；而ATO NPs@AucRGD+UTMD+laser+抗PD-L1 mAb组未见明显肺结节，验证了该联合用药可以抑制肝癌原位肺转移（图7H）。免疫荧光法评价肿瘤组织血管生成情况，选取血小板内皮细胞粘附因子和血管标志物CD31作为评价血管生成指标。PBS组CD31表达较多，提示肿瘤生长转移较快。ATO NPs@Au-cRGD+UTMD+laser+anti-PD-L1 mAb组CD31表达最低（图7I），进一步证实联合用药通过促进肿瘤细胞死亡，有效抑制肿瘤生长和转移。 总之，该研究的研究结果表明该研究的联合疗法能有效减缓原发性肝肿瘤的生长，并引发全身抗肿瘤免疫反应，从而抑制肝癌肺转移。

结论：
该研究报道了一种纳米超声造影剂的构建，该造影剂可以实现超声成像，并通过铁死亡和PTT治疗比游离药物更有效地刺激免疫反应。与PD-L1抗体结合，ATO/PFH NPs@Au-cRGD纳米药物递送系统可以通过激活全身免疫有效抑制肝脏原位肿瘤并抑制肺转移。这些数据支持多种治疗相结合的概念，为未来研究解决肝癌治疗的临床需求奠定了基础，并可能对肝癌以外的其他实体肿瘤的治疗产生影响。

DOI:https://doi.org/10.1002/advs.202300878
期刊名称：ADVANCED SCIENCE