苏州医工所揭秘：超分辨显微镜如何改变科研？

苏州医工所揭秘：超分辨显微镜如何改变科研？

引用

中国科学院

等

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来源

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显微镜作为人类探索微观世界的重要工具，其分辨率的提升一直是科学家追求的目标。近年来，超分辨显微镜技术的突破，使得人类能够突破光学衍射极限，观察到更精细的细胞结构和生物分子，为生命科学、医学等领域的研究带来了革命性的变化。

传统的光学显微镜受到光的衍射限制，分辨率只能达到约200纳米。为了突破这一限制，科学家们开发了多种超分辨显微成像技术，其中最具代表性的是受激辐射耗尽（STED）、光激活定位显微（PALM）、随机光学重建显微（STORM）和结构光照明超分辨显微成像（SIM）等技术。

• STED技术：通过引入一束损耗光来抑制荧光分子的激发，从而减小荧光点的扩散范围，提高成像分辨率。但成像过程中损耗光的能量比较高，容易发生光漂白现象。

• SIM技术：利用结构化的光场对样品进行照明，并收集不同角度下的衍射图像以重建出高分辨率图像。该技术在活细胞成像中表现尤为出色，适用于活细胞的长时程动态观察。

• STORM和PALM技术：通过对荧光标记样品中荧光分子的随机激活和精确的光子定位实现超分辨成像。但需要数万帧图像进行重建，时间分辨率较低。

近年来，国内多个研究机构在超分辨显微镜技术方面取得了重要进展。例如，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所、中国科学院西安光学精密机械研究所、北京大学、西安交通大学和深圳大学等，在算法和系统优化方面对SIM进行了重要改进。

近期，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所史国华团队在介观显微成像领域取得重要进展。他们设计了介观视场下的平场复消色差物镜结构，研制出已报道的亚微米分辨率下成像视场最大且工作波段最宽的介观显微物镜。

该物镜具备以下特点：

• 成像视场直径：8mm，是目前报道中亚微米分辨率下最大的成像视场。
• 数值孔径（NA）：0.5，保证了高分辨率成像。
• 成像波段：400-1000nm，覆盖可见光和近红外波段，满足多样化荧光成像需求。

研究团队利用该物镜对小鼠脑和肾切片进行成像，获得了单帧13.5亿像素的超高通量图像。与20倍0.5NA的商业物镜相比，该介观物镜拥有超过40倍的成像视场面积，且成像质量相当。此外，该物镜还实现了单光子/双光子介观成像，显示出在大尺度样本高分辨多波段成像方面的潜力。

超分辨显微镜技术在科研领域的应用日益广泛，特别是在神经科学研究中展现出巨大潜力。例如，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心王凯研究组开发了新型超分辨显微成像技术——多模式复用结构光线照明超分辨显微成像技术（MLS-SIM）。

MLS-SIM技术解决了背景噪声干扰和运动伪影两大技术难题，首次实现了在清醒动物脑中对神经元结构的超分辨成像。该技术的关键创新在于：

• 在单次线扫描成像过程中通过快速切换不同的线照明模式来分别获得三个方向上的超分辨信息。
• 提出了新的超分辨重构理论框架，实现准确高效的超分辨图像重构。

在线性荧光激发模式下，MLS-SIM可以实现150纳米横向分辨率，对清醒小鼠皮层中神经元树突棘尖刺和轴突终扣进行长达上千帧的连续成像，速度达每秒数帧。通过皮秒脉冲激光实现非线性荧光激发后，横向分辨率可进一步提高至约100纳米。

利用这一技术，研究团队在清醒的小鼠大脑中验证了神经元树突棘和轴突终扣上存在快速变化的尖刺动态，并量化研究了清醒-睡眠循环中神经元的微观快速动态的改变。同时，该技术实现了双色超分辨同时成像，剖析了PSD-95蛋白聚团的微观结构与树突棘发生之间的联系。

超分辨显微镜不仅在科研领域大显身手，在临床应用中也展现出独特优势。例如，Evident公司的IXplore SpinSR显微镜系统能够在3D样品和活细胞实验中快速显示超分辨率细节，同时降低光损伤，延长细胞生存时间。

在临床应用中，超分辨显微镜能够：

• 实现3D样品的清晰成像，降低模糊度。
• 通过选择高数值孔径（NA）物镜提升成像分辨率。
• 使用与活细胞折射率接近的硅酮油水浸物镜，减少球面像差，实现更明亮、更高分辨率的3D成像。

在超分辨显微镜领域，国内外研究机构都在积极创新。例如，南京理工大学左超教授课题组在Advanced Imaging上发表综述论文，总结了基于荧光超分辨成像技术的经典有膜与无膜细胞器形态、功能及互作效应的研究现状。

国内研究机构在某些关键技术上已达到国际先进水平：

• 苏州医工所的介观显微物镜在成像视场和分辨率方面实现突破。
• 王凯研究组的MLS-SIM技术填补了超分辨显微镜在清醒动物上开展成像的空白。
• 多个研究机构在SIM技术的算法和系统优化方面取得重要进展。

超分辨显微镜技术的未来发展方向包括：

• 提高时间分辨率：通过深度学习等技术缩短图像重建时间。
• 多模态成像：结合不同超分辨率技术的优势，实现更全面的成像效果。
• 改进荧光探针：开发具有更好生物相容性的荧光探针，降低光毒性。
• 临床转化：推动超分辨显微镜技术在临床诊断和治疗中的应用。

随着技术的不断进步，超分辨显微镜将在生命科学、医学等领域的研究中发挥越来越重要的作用，帮助科学家揭示更多细胞生命的奥秘。