细胞移植没氧气？别怕，有氧合呼吸生物系统
细胞移植没氧气？别怕，有氧合呼吸生物系统
细胞移植作为治疗多种疾病的潜在疗法，一直备受关注。然而，如何确保移植细胞拥有充足氧气一直是该领域面临的关键难题。近日，发表在《Nature Communications》上的一项研究提出了一种创新的氧合呼吸生物系统，有望为解决这一难题提供新的思路。
研究背景与挑战
在细胞移植领域，尽管取得了一定进展，但仍面临诸多挑战。其中一个关键问题是为移植的细胞提供充足氧气。在细胞移植中，移植的细胞处于相对低氧环境且无内部氧供，在三维结构中会消耗氧气形成缺氧环境，核心区域缺氧更为严重。缺氧会触发细胞内缺氧诱导因子（HIFs）的稳定和激活，还会降低线粒体电子传递链效率，产生大量活性氧（ROS），如超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基等。这些因素可能导致DNA损伤、突变，使细胞周期停滞。例如，在一些细胞移植实验中，缺氧环境下的细胞功能受损，无法正常发挥其生理作用。
目前，为增强组织构建的氧合作用，虽已开发多种氧释放生物材料（ORBs），但仍存在问题，如控制氧气释放和避免有害副产物方面面临挑战。同时，光合藻类作为氧生成生物材料（OGBs），其应用受限于光照区域，且需进一步的安全研究。
氧合呼吸生物系统的构建与原理
系统组成与设计思路
研究采用了从陆地植物中分离的叶绿体作为氧源，结合叶绿体转运肽（CTP）与藻酸盐构建氧合呼吸生物系统。CTP对于维持叶绿体结构和功能至关重要，它能够锚定在叶绿体外膜上，增强叶绿体的结构稳定性，同时上调光合作用相关基因的表达，从而实现持续自供氧。
CTP对叶绿体的作用机制
- 结构稳定性增强
CTP的序列为Met(M)-Phe(F)-Ala(A)-Phe(F)-Gln(Q)-Tyr(Y)-Leu(L)-Leu(L)-Val(V)-Met(M)，来源于拟南芥TOC34的跨膜结构域。实验表明，CTP能够完全覆盖叶绿体表面，在20小时的孵育过程中不损害其结构，罗丹明B染色证实了这一点。同时，CTP处理显著降低了叶绿素的释放量，表明其稳定了叶绿体结构，使处理后的叶绿体在14天后仍保持较高浓度。
- 光合效率提升
在缺氧条件下，无论是否有光照，CTP处理的叶绿体在20小时内都能保持较高的氧合水平，即使在加入抑制氧释放的铝离子（Al³⁺）后也是如此。通过对光系统II（PSII）相关参数的测量，如有效量子效率（Y(II)）、电子传递速率（ETR）、表观量子产率（α）和最大光合速率（Pmax）等，发现CTP处理后的叶绿体这些参数值均高于仅用Al³⁺处理的叶绿体。
- PSII复合物相关蛋白表达增加
对PSII复合物的研究发现，CTP处理能显著增加与氧释放（水氧化）活性相关的三个外在蛋白PsbO、PsbP和PsbQ的表达。SDS-PAGE分析表明，CTP处理14天后，这些蛋白亚基的表达明显高于仅用Al³⁺处理的情况，且在缺氧条件下，CTP处理的PSII复合物的氧合水平显著高于其他处理。
CTP作用的分子机制
通过RNA测序（RNA-seq）分析发现，CTP处理可显著增加RNA含量，基因集富集分析（GSEA）确定了一系列显著上调的基因。功能注释分析表明，CTP处理上调了与光合作用和蛋白质翻译相关的基因，特别是与类囊体膜蛋白相关的基因。此外，CTP还显著上调了叶绿体核糖体蛋白。这些结果表明，CTP的调节信号可促进类囊体膜蛋白的合成，最终激活光合作用和氧合作用。
为进一步研究，设计了针对PSII和核糖体亚基关键蛋白的小干扰RNA（siRNA），并进行转染实验。结果发现，CTP处理能显著上调psbA、psbO、rps12和rpl14的mRNA水平，且在缺氧或正常氧环境下，CTP处理均能恢复siRNA处理的叶绿体的氧合功能。这表明CTP可与叶绿体中的氧合相关基因发生分子反应。
氧合呼吸生物系统的优化
CTP与藻酸盐的偶联
通过碳二亚胺化学法将CTP的N端与生物相容性藻酸盐（Al）的羧基进行化学偶联。实验确定了最佳的偶联摩尔比为1:1，此时CTP与藻酸盐成功通过酰胺键结合形成Al-CTP偶联物，且不影响水凝胶的形成。通过流变学分析，发现Al-CTP水凝胶与传统藻酸盐水凝胶的储能模量和损耗模量相似。
生物系统的封装与条件优化
将Al-CTP偶联物、叶绿体和治疗性细胞封装在微胶囊中，系统评估了封装条件，包括封装器的设置（如频率、电极、流速等）和不同钙浓度对系统的影响。优化后的条件确保了生物系统的有效形成，同时发现钙浓度可调控生物系统的降解性，而不影响氧气产生。
氧合呼吸生物系统的功能验证
体外细胞实验
- 胰岛细胞封装与形态观察
扫描电子显微镜（SEM）分析显示，封装胰岛细胞的微胶囊呈球形且结构紧凑。在含有叶绿体的微胶囊（如Al-Ch和氧合呼吸生物系统）中，可观察到叶绿体的存在，其表面微观结构不均匀。成功封装胰岛细胞后，测量微胶囊中叶绿素释放量，发现氧合呼吸生物系统在14天内释放的叶绿素量低于Al-Ch，且两种微胶囊在14天后仍保持球形。
- 缺氧条件下的细胞活力与功能维持
在缺氧条件下，氧合呼吸生物系统中的胰岛细胞活力显著高于完整胰岛细胞和Al-CTP微胶囊中的胰岛细胞。活/死细胞染色实验表明，氧合呼吸生物系统中的胰岛细胞死亡信号减少。葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）测试显示，尽管在缺氧环境中胰岛细胞的葡萄糖反应性受损，但封装在氧合呼吸生物系统中的胰岛细胞胰岛素分泌模式与正常氧条件下相似，刺激指数（SI）也得到恢复。免疫染色结果显示，氧合呼吸生物系统中的胰岛细胞在缺氧条件下HIF-1α表达较低，胰岛素表达较高。
体内移植实验
- 皮下移植
在糖尿病小鼠模型中进行皮下移植实验，测量移植区域的氧气水平发现，氧合呼吸生物系统移植后，尽管皮下区域通常氧气含量低，但仍显著增加了氧气水平。监测糖尿病小鼠的体重和血糖水平表明，氧合呼吸生物系统在维持血糖水平方面优于Al-CTP微胶囊，至少可持续14天。免疫染色显示，皮下移植的氧合呼吸生物系统中胰岛细胞HIF-1α表达较低，胰岛素表达较高，巨噬细胞浸润不明显，纤维化程度低，有利于营养/氧气扩散和胰岛素长期分泌。
- 腹腔内移植
腹腔内移植实验中，植入Al-CTP微胶囊的小鼠在30天后血糖恢复至高水平，而植入氧合呼吸生物系统的小鼠在85天以上保持正常血糖水平，且微胶囊未被排斥。在100天后，氧合呼吸生物系统大多自由漂浮在腹腔内，与腹部器官粘连少，仍包裹着胰岛细胞，形态保持清洁透明。免疫染色显示，移植后的胰岛细胞HIF-1α表达低，胰岛素表达高。腹腔内葡萄糖耐量测试（IPGTT）表明，氧合呼吸生物系统处理的小鼠血糖和血清胰岛素水平模式与非糖尿病健康小鼠相似。
研究结论与展望
本研究成功开发了一种氧合呼吸生物系统，该系统通过将植物叶绿体与生物相容性藻酸盐-CTP偶联物相结合，能够在无需抗氧化剂和光照的情况下长期自发供氧，为移植细胞提供了适宜的生存环境。在分子机制层面，CTP通过调节基因表达，增强了叶绿体的光合效率和氧气释放能力，促进了蛋白质合成，激活了光合作用，且在无光照条件下也能发挥作用。
通过体内外实验验证，该生物系统在治疗性细胞移植方面具有显著优势，能有效提高胰岛细胞等治疗性细胞的存活和功能，为治疗糖尿病等疾病提供了新的策略。未来，期望该氧合呼吸生物系统能够应用于更大规模的组织工程构建，克服目前临床组织工程构建尺寸受限的问题，为细胞疗法提供更有效的支持，推动组织工程和再生医学领域的发展。
参考文献：
Jang S, et al. Oxygenating respiratoid biosystem for therapeutic cell transplantation. Nat Commun. 2024 Oct 23;15(1):9151.