抗菌肽Indolicidin：最小的天然线性抗菌肽
抗菌肽Indolicidin：最小的天然线性抗菌肽
抗菌肽Indolicidin是从牛中性粒细胞细胞质颗粒中分离得到的一种抗菌肽，是目前已知最小的天然线性抗菌肽。它具有抗菌谱广、热稳定性好、水溶性好等优势，是国内外研究的热点。本文将详细介绍Indolicidin的结构特点、抗菌机理、构效关系及其发展前景。
Indolicidin的结构特点
Indolicidin的结构为ILPWKWPWWWPWWRR-NH2，包含6种共13个氨基酸，其中5个是色氨酸残基。该多肽的羧基端被酰胺化，共包含39%的色氨酸残基和23%的脯氨酸残基，这也是Cathelicidins家族已知蛋白中色氨酸含量最高的。
Indolicidin的特点
- 抗菌谱广：对多种革兰氏阳性菌、阴性菌以及真菌均有很强的抗菌活性。例如，对铜绿假单胞菌、念珠菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，其杀菌量为0.1~1.0 umol。
- 对寄生虫和病毒有抑制作用：单独使用Indolicidin浓度达到50 μmol / L可降低微小隐孢子虫裂殖子浓度至38.5%。同时，对人类免疫缺陷病毒（HIV-1）、单纯疱疹病毒也有抑制作用，抗HIV-1病毒的杀病毒质量浓度为333ug/ml，在37℃条件下IC50为67~100ug/ml。37℃作用5 min即可抑制50％的HIV病毒，而要起到完全抗病毒作用大约需作用60 min。
Indolicidin的抗菌机理
研究者利用化学交联和质谱足迹法进行Indolicidin抑制HIV-1整合酶的作用机理研究，结果表明Indolicidin可直接与DNA结合阻碍整合酶-DNA复合物的形成，而不是与整合酶相结合。由此推测Indolicidin通过与DNA的结合可能抑制大量的与DNA加工相关的酶。
2014年，研究者在试验中发现Indolicidin十三肽中间的PW-WP结构域是一个特殊的结构原件，该结构域能够包绕B-型DNA双螺旋结构，使其稳定性更好，从而对DNA的复制和转录起到了抑制作用。通过荧光显微镜观察用FTTC标记的Indolicidin不仅能够定位于A549肺癌细胞细胞膜，而且能够定位至细胞核，证实了Indolicidin可以结合于双螺旋DNA上，这也间接证明了Indolicidin可能是通过与DNA结合而发挥抑制作用。
研究者继续进行研究，利用圆二色谱和质谱对indolicidin和DNA复合物热变性进行研究，研究表明，复合物的解链温度比正常DNA的解链温度要高（63.2℃ vs 52.2℃）。研究者进一步使用A-A、H-H、P-P等替代PWWP中的WW，结果大大影响了其稳定双螺旋DNA的能力，可能时由于WW被替换后减少了多肽的表面积和疏水性，同时也说明了PWWP是与DNA识别结合时的重要作用，且色氨酸残基起到了重要作用。
综上所述：Indolicidin的抑菌机制可能是由于通过增加细胞膜的通透性，使自身进入细菌内部，一方面能够促使细菌内容物外流，另一方面能够与细菌DNA及DNA复制相关的蛋白质大分子相结合，抑制DNA的复制，从而起到杀菌的作用。
Indolicidin的构效关系
蛋白质实现不同功能主要是依靠构成它的氨基酸的化学性质的多样性以及肽链折叠方式的多样性。因此研究者从在蛋白质中发挥关键作用的氨基酸功能进行深入研究，通过突变或缺失或多肽中的关键氨基酸等方式，探讨其在蛋白质/多肽中的作用以及该蛋白质发挥的机理。根据indolicidin自身特点，对色氨酸、脯氨酸在indolicidin发挥生物活性的过程进行分析，同时也为后期研究该抗菌肽的人工改造技术提供科学依据。
羧端修饰的重要性
研究者合成一系列Indolicidin衍生物进行试验研究，结果显示，在合成Indolicidin衍生物中羧基端甲酯化比羧基端未甲酯化的Indolicidin抗菌效果好，尤其是对于野生型的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌以及葡萄球菌属细菌作用效果好，MIC介于4~64ug/ml。而另一端缺乏C端精氨酸残基的衍生物比Indolicidin的抗细菌活性和抗真菌活性都低。羧基端被修饰后的Indolicidin对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均显示出更高的活性，这可能是由于增加了净正电荷，同时也印证了其能够增加对脂多糖(LPS)的结合能力，从而提高其外膜渗透作用。
色氨酸的重要性
色氨酸残基能够提高多肽分子进入脂质双分子层的能力，同时也导致了溶血作用的产生。研究者先使用苯丙氨酸完全取代其中的5个色氨酸，抗菌结果并无显著影响，但是溶血性几乎完全消失。
Subbalakshmi等研究者对indolicidin第4位、8位、11位保留色氨酸，其他色氨酸被亮氨酸替代，结果显示这些衍生物对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌仍有活性，但是和Indolicindin相比较稍微有所降低。这些衍生物的溶血性却完全消失。
Ryge等研究者通过衍生化的甘氨酸残基或者其他非天然氨基酸取代其中的5个色氨酸，测定这些衍生物的抗菌活性，研究表明：用3-(2-萘基)甘氨酸取代色氨酸的Indolicidin抗菌活性最佳，对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值分别为1.2umol/L和2.3umol/L；用5个修饰的脯氨酸取代色氨酸的Indolicidin显示出抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值至少提高3倍。
Ando等研究者合成了一系列Indolicidin中色氨酸单个替换的衍生物，并考查了这些多肽的抗菌活性和溶血作用，结果显示Indolicidin中第11位的色氨酸对于抗菌活性和溶血活性都相当重要且不可替换成其他氨基酸，而第4位和第9位的色氨酸分别对抗菌活性和溶血活性具有重要作用，第6位和第8位的色氨酸对于生物活性几乎无作用。而Indolicidin的逆向衍生物比Indolicidin具有更好的抗革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)的活性，且其溶血活性显著降低。
脯氨酸的重要性
Indolicidin中含有3个脯氨酸，主要位于第3、7、10位，研究者分别用丙氨酸、赖氨酸完全替代3个脯氨酸，结果丙氨酸替代的衍生物抗菌活性并未消失，溶血性却增加，然而赖氨酸衍生物和Indolicidin的抑菌活性、抗炎活性、中和LPS的能力相当，有望成为新型的抗菌药物。
研究者继续进行研究，用丙氨酸替代一个或者多个脯氨酸，结果表明脯氨酸对Indolicidin与脂多糖的相互作用至关重要，且第3位和第10位脯氨酸残基对Indolicidin发挥抗菌活性尤为重要。由此说明脯氨酸是为了让Indolicidin能够更好适应不同构型的”LPS“。
研究者在Indolicidin中引入赖氨酸(例如：ILKKWPWWPWRRK)，并且将其C端甲基酯化，该衍生物较Indolicidin活性提高4被且无溶血性。研究结果反映了净正电荷对于其抗细菌活性的重要性。其他一些Indilicidin衍生物，用异亮氨酸或甘氨酸分别替换第4位、第6位、第8位的色氨酸，衍生物显示出更好的抗细菌活性，然而缺乏这些衍生物溶血性的报道。
Indolicidin的发展前景
近年来，对于Indolicidin的结构特性、生物学活性、作用机制及构效关系等的研究取得了显著的进展。Indolicidin的衍生物MBI-226已进入Ⅲ期临床阶段，而Indolicidin的一些其他衍生物已作为治疗痤疮的药物进入Ⅱ期临床试验。但抗菌肽的纯化技术存在困难，合成成本较高，因此利用体外表达技术，通过构建基因工程菌提高其表达量，进一步改进分离和纯化技术，降低其生产成本，对其临床制剂的开发和广泛应用具有重要意义。
参考文献：
【1】王 婧，刁小龙，陈晓兰，等. 抗菌肽Indolicidin的研究进展[J].江苏农业学报，2018，34(4):949-954. Doi:10.3969 / j.issn.1000-4440.2018.04.034