水稻超氧化物歧化酶(SOD)活性测定方法详解

水稻超氧化物歧化酶(SOD)活性测定方法详解

一、实验原理

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）是一种清除超氧阴离子自由基的酶。在逆境环境下，超氧阴离子自由基会大量积累，诱导植物体内产生SOD。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收峰。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

二、实验试剂

1. Na2HPO4
2. NaH2PO4
3. 甲硫氨酸（Met）
4. EDTA-Na2
5. 氮蓝四唑（NBT）
6. 0.05 mol/L磷酸缓冲液
7. 130 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液
8. 750 µmol/L氮蓝四唑溶液
9. 100 µmol/L EDTA-Na2溶液
10. 20 µmol/L核黄素溶液

三、实验步骤

1. 水稻组织样品准备：到温室或田间取样，立即放置于样品袋中，存放于冰盒中带回。

2. 酶液提取：在天平上迅速称取水稻组织0.3-0.5 g，剪刀剪碎到预冷的研钵中，加1 ml预冷的磷酸缓冲液，在冰浴上研磨成浆，研磨过程中补加缓冲液使终体积为4 ml。将研磨液倒于10 ml离心管中，4 °C 5,000x g离心10 min。上清液即为SOD粗提液。

3. 显色反应：取2 ml离心管若干，其中2个离心管做对照用，按下表加入各种溶液，各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处，其他各管迅速混匀，放置于光照培养室中反应10 min-30 min（保证各管受光情况一致，温度高时间缩短，温度低时间延长）。

4. SOD活性测定：至反应结束后，全部移入冰盒中，其上可覆盖遮光物，再冷冻离心12,000x g后取适量反应液测定，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。

5. SOD活性计算，计算公式：SOD (U/g.FW) = (Ack-AE) * VT/Ack/0.5/W/Vs

公式中式符号表示：
VT-总酶液量(ml)
Vs-所用酶液量(50 μl)
W-叶片鲜重(g)
Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度
AE-样品管吸光度