PROTAC设计中Linker特性的探索与创新

PROTAC设计中Linker特性的探索与创新

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PROTAC（靶向嵌合体蛋白水解）技术是药物发现领域的突破性发展，通过泛素蛋白酶体系统特异性降解与疾病相关的蛋白质。PROTAC具有独特的异双功能结构，包括两个通过linker连接的功能域。Linker在确定PROTAC的生物降解功效方面发挥着关键作用。本文将从PROTAC linker的结构类型和特点、合理设计与优化策略以及linker特性对PROTAC生物降解效率的影响三个方面进行分析讨论。

PROTAC linker的结构类型和特点

PROTAC linker大致可分为两类：柔性linker和相对刚性linker。

柔性linker是应用最广泛的类型，主要包括烷基linker和聚乙二醇（PEG）linker。在PROTAC设计中普遍存在的柔性linker通常使用长而灵活的结构。然而，这种设计可以增加体内氧化代谢的易感性。

相比之下，由于PROTAC领域合成技术的限制，相对刚性的linker的使用频率较低，共包括8种类型。其中，环烷烃特别是包含哌嗪和哌啶成分的linker经常被使用，因为它们增加了三元复合物的溶解度和稳定性。基于三唑的linker是另一种常用的刚性linker，由于点击化学反应的出现，使用铜催化的1，3-偶极环加成反应，与不同的官能团具有很高的相容性和一致的反应速率。另一种类型的linker，光控PROTAC linker，如光开关PROTAC linker，使用偶氮片段而不是烷基或聚醚片段，当暴露在特定波长的光下时，导致产生的PROTAC进行可逆的光异构化。这使得精确和相互调节PROTAC生物降解率成为可能（图1）。

图1. PROTAC连接器的结构类型和特点（A、B、C)

PROTAC linker的合理设计与优化策略

一般来说，PROTAC linker的设计和优化依赖于经验或计算机辅助方法。基于经验设计和优化PROTAC linker大致历程为：

1. 调整linker长度以达到特定PROTAC的最佳配置；
2. 修改linker的类型以平衡PROTAC的亲疏水性；
3. 修改linker和连接位点的灵活性，以增加三元复合物的稳定性；
4. 设计和合成具有不同linker的多种PROTACs。

而基于计算机辅助策略的一般过程是：

1. 使用晶体学或分子对接技术分别确定POI（蛋白质靶点）与其配体和E3（泛素连接酶）与其配体的结合模式；
2. 利用MOE、Rosetta、PatchDock等计算软件进行全局蛋白-蛋白对接模拟，得到POI-配体和E3-配体的模型结构集合；
3. 使用分子动力学（MD）进行评估后，使用合理的模型结构来分析蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），并识别在其结合口袋近端相互作用的蛋白质；
4. 设计不同的linker以生成一系列POI-PROTAC-E3构象。对三元配合物的结构活性关系（SAR）和结合方式的进一步分析，最终得到最优的linker。

该策略广泛适用于linker的设计和优化，然而，这种方法有一定的局限性。这种方法通常需要综合多个带有各种linker的protac来全面了解SAR，这可能耗时、费力且成本高。另一个限制是理论预测的准确性，它会影响linker的设计。

近年来，人工智能在PROTAC接头设计中的应用显著提高了linker优化的精度和效率。通过利用人工智能策略，研究人员已经深入了解了PORTAC linker的结构、物理和化学性质。这些见解已经转化为实际应用，导致更精确的PROTAC linker设计（图2）。

图2. 适用于PROTAC linker的设计和优化策略

Linker的特性对PROTACs生物降解效率的影响

PROTAC是一种异双功能分子，由靶蛋白配体和E3连接酶配体通过不同的linker连接起来，该结构有助于稳定的三元复合物的建立，从而导致靶蛋白泛素化被生物体内的26s蛋白酶体识别并降解。

研究发现linker的特性在三元复合物的稳定形成和PROTAC的理化性质和药代动力学性质中起关键作用。

首先，linker的长度显著影响POI-PROTAC-E3三元复合物的形成，最佳的linker长度取决于三元复合物的相互作用模式、距离和空间结构，如果linker过长，可能会削弱POI与E3连接酶之间的相互作用，降低形成稳定三元复合物的可能性。相反，较短的linker可能会引入空间位阻，破坏三元复合物的形成，降低PROTAC的生物降解效率。

其次，linker的化学组成直接影响了PROTAC的理化性质，这些性质反过来影响了PROTAC的细胞通透性，从而显著影响了PROTAC的生物降解效率。

因此，实现最佳的连接体长度对于在POI和E3连接酶之间产生最大的相互作用至关重要，从而导致POI的有效泛素化和生物降解。另一方面，linker的灵活性是决定PROTACs生物降解效果的关键因素，具有显著构象灵活性的linker可以增强PROTAC、POI和E3蛋白之间的相互作用，从而阻止它们在固定界面上的稳定结合。

相反，在柔性linker中引入刚性基团可以提高PROTAC的刚性，并复制PROTAC中POI及E3配体的原始几何形状，从而产生新的相互作用，提高三元复合物的稳定性。

此外，linker与POI以及E3的连接位点会影响POI与E3之间的相互作用。PROTAC linker的优化通常包括确定最有利的结构衍生化位点，从而确保保留最大的结合亲和性。这种选择过程通常包括分析POI-配体或者E3-配体相互作用界面的溶剂暴露区域，通过在溶剂暴露区引入最优的linker，可以最大化蛋白质-蛋白质相互作用，同时保留原始配体与POI或者E3的相互作用。

鉴于这些错综复杂的关系，很明显，linker是确保PROTAC更高特异性和靶向效率的关键因素（图3）。

图3. linker的特性对PROTACs生物降解效率的影响

虽然优化linker的长度、基团类型、柔韧性和连接位点可以提高PROTACs的疗效，但必须克服几个挑战。

1. PROTAC结构的复杂性和多样性阻碍了清晰的构效关系的建立。为了解决这一问题，探索特定生物降解系统的最佳linker特性可以促进快速识别更有效的PROTACs；
2. PROTAC的物理化学性质经常偏离经典的类药5原则，需要研究适合PROTAC的药物相似规则，以最大限度地减少设计出药代动力学特征差的PROTAC的可能性；
3. 由于大分子量和复杂的结构，纯化和低收率给PROTAC的合成和优化带来了挑战。因此，开发针对PROTACs的先进合成技术对于获得更广泛的结构类型至关重要；
4. 由POI-PROTAC-E3组成的三元配合物的大尺寸使晶体结构的测定变得困难。为了解决这个问题，有必要发展先进的晶体学技术或更精确的计算模拟方法，以获得进一步优化的见解。

我们相信，解决这些问题将大大促进PROTAC研究的进展。

总之，这篇文章从多学科的角度分析PROTAC连接体的结构和性质及其对PROTAC生物降解效果的影响。希望能为PROTAC linker的合理设计提供有价值的见解。

我们主要分析了三个关键领域：

1. 分析了迄今为止报道的PROTAC连接器的各种结构类型和特性；
2. 合理设计有效PROTAC接头所采用的优化策略；
3. 连接子长度、基团类型、柔韧性和连接位点对三元配合物形成、药代动力学、蛋白-蛋白相互作用以及最终对PROTAC生物降解效率的影响。

希望这篇文章能够增加对PROTAC连接器合理设计的理解，从而促进该领域未来的研究。

参考文献

[1] Characteristic roadmap of linker governs the rational design of PROTACs
[2] Unraveling the Role of Linker Design in Proteolysis Targeting Chimeras
[3] Impact of linker length on the activity of PROTACs.