Cell Reports | 突破瓶颈！功能性胸腺上皮类器官系成功培育
Cell Reports | 突破瓶颈！功能性胸腺上皮类器官系成功培育
胸腺，这个免疫系统中至关重要的器官，近日迎来了新突破。研究人员成功地从成年小鼠胸腺中培育出功能性胸腺上皮类器官系，为我们揭开了胸腺上皮细胞发育和功能的新篇章，为免疫治疗和再生医学领域带来了前所未有的可能性。随着科学技术的不断进步，我们正迈向更深入的认识和应用胸腺生物学的新时代。
研究背景
胸腺上皮细胞在T细胞的发育过程中起着至关重要的作用，然而，由于缺乏长期稳定的体外培养平台，我们对它的研究一直受到极大的限制。过去的研究表明，胸腺上皮细胞（TEC）的扩展能力相当有限，这使得我们难以在体外环境中精确模拟TEC的异质性。为了突破这一研究瓶颈，本研究致力于解决TEC的长期培养和功能性分化问题，以期为体外T细胞发育提供全新的研究策略和方法。
研究方法
- 使用6-12周龄的野生型C57BL/6小鼠的胸腺组织生成TEC类器官。
- 优化的TEC类器官扩增培养基（EM）包含Wnt替代物、R-spondin 3、Noggin、EGF、FGF7、FGF10、A83-01、烟酰胺和N-乙酰半胱氨酸。
- 类器官呈“一串葡萄”的形态，并且可以每14天以1:6的比例传代，连续增长超过2年。
- 类器官的增殖依赖于Wnt/R-spondin 3、EGF和A83-01，并且通过FGF7和FGF10增强。
- 使用CRISPR-Cas9介导的非同源修复生成了具有胸腺上皮标记基因的克隆报告类器官。
研究结果
1. 生成3D TEC类器官
研究人员根据之前的经验，优化了成体干细胞衍生的类器官方案，通过切碎小鼠胸腺组织并包埋在基膜萃取液（BME）中。优化后的TEC类器官扩增培养基(EM)由Wnt替代物、R-spondin3、Noggin、EGF、FGF7、FGF10、转化生长因子b抑制剂A83-01、烟酰胺和n -乙酰半胱氨酸组成，研究人员发现生长的类器官，具有复杂形态并可长期传代。类器官的增殖依赖于多种生长因子，并可通过单细胞克隆再生。此外，研究人员还利用CRISPR-Cas9技术在TEC类器官中进行了转基因操作。这种将TEC培养为三维类器官的稳健方法表明，成人胸腺含有能在体外自我更新的上皮干细胞（图1）。
图1
2. TEC类器官概括了TEC类型的多样性
研究人员通过标记分析对TEC类器官进行了表征，发现其表达与初级TEC相当的分子，但分化为mTEC或cTEC的功能分子表达较低。分化培养基孵育后，类器官形态发生变化，scRNA测序显示EM和分化培养基（DM）培养的类器官中存在不同亚群。部分亚群表达干细胞标记物，表明EM中的类器官维持了TESC样细胞，而另一些亚群则表达mTEC或cTEC相关基因，暗示其分化潜能。这些分析表明，小鼠3D TEC类器官概括了TEC细胞的多样性（图2）。
图2
3. TEC类器官中mTEC和cTEC的分化
根据糖尿病诱导细胞表现出早期或出生后的祖细胞样特征，研究人员试图确定刺激向功能性mTEC和cTEC分化的其他因素。通过scRNA-seq数据集研究相关基因表达，发现RANK信号和RAR信号分别诱导mTEC和cTEC分化。通过优化三步分化方案，发现DM+RR培养基中的类器官形态变化，并观察到三种不同形态的TEC。进一步验证显示，分化的类器官包含cTEC样和mTEC样亚群，并表达相关基因。流式细胞术证实mTEC和cTEC蛋白标志物的表达。这些数据支持TEC类器官的三步分化再现了体外mTEC和cTEC的分化。然而，未分化的tec既不是分化的mTEC，也不是cTEC，仍然存在于DM+ RR培养的类器官中（图3）。
图3
4. 功能性mTEC和cTEC基因在分化的TEC类器官中表达
无偏scRNA-seq分析和流式细胞术分析显示，DM+RR培养的类器官中mTEC和cTEC发生了分化。通过进一步分析，我们证实了与TRA表达、抗原呈递和胸腺细胞运输相关的功能基因在类器官中的表达。在DM+RR培养的类器官中，mTEC和cTEC的关键基因表达显著，与原发性TEC相当。此外，新建立的类器官与长期培养的类器官在基因表达上没有显著差异。这些数据表明TEC类器官能够分化为mTEC和cTEC（图4）。
图4
5. TEC类器官支持胸腺细胞成熟
研究人员将小鼠TEC类器官与胸腺细胞共培养，实验结果表明与TEC类器官共培养的胸腺细胞显著促进了其成熟和发育过程。此外，胸腺细胞的存在也诱导了TEC类器官的进一步分化。通过共培养DN胸腺细胞与TEC类器官，研究人员成功模拟了胸腺细胞发育的早期阶段，并再现了αβ T细胞的发育过程。研究人员还通过构建过表达OVA的TEC类器官，并与特定胸腺细胞共培养，模拟了抗原特异性阴性选择过程，证明了TEC类器官的抗原呈递功能。为了验证TEC类器官在胸腺细胞发育中的作用，研究人员将其移植到胸腺功能缺失的Foxn1nu裸小鼠和常规T细胞中。结果显示移植的TEC类器官成功支持了T细胞的发育。同时，流式细胞术和免疫荧光测定显示，移植的TEC类器官与CD45+细胞共定位，并为T细胞发育提供了功能微环境（图5）。
图5
小结
本研究成功地从成年小鼠胸腺中衍生出功能性胸腺上皮类器官。研究团队通过使用CRISPR-Cas9介导的技术，将荧光报告基因序列引入小鼠胸腺上皮细胞类器官，为研究提供了有力的工具。他们还进行了移植实验，证明这些类器官在体内支持T细胞的发育。这项研究为理解胸腺上皮细胞的发育和功能提供了新的视角，也为再生医学和免疫治疗领域的应用提供了新的可能性。
参考文献
Lim S, J F van Son G, Wisma Eka Yanti NL, Andersson-Rolf A, Willemsen S, Korving J, Lee HG, Begthel H, Clevers H. Derivation of functional thymic epithelial organoid lines from adult murine thymus. Cell Rep. 2024 Mar 27;43(4):114019. doi: 10.1016/j.celrep.2024.114019. Epub ahead of print. PMID: 38551965.
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