实时聚合酶链反应（qPCR）：原理、优势及应用领域全解析

实时聚合酶链反应（qPCR）：原理、优势及应用领域全解析

实时聚合酶链反应（qPCR）是一种强大的工具，用于检测和测量DNA或RNA，其准确度前所未有。与常规PCR不同，qPCR不需要凝胶电泳来可视化结果，因此能够实现快速周转、最小化污染风险和简化工作流程。

实时PCR（qPCR）的关键优势

实时PCR（qPCR）在定量范围、检测灵敏度、工作流程、自动化程度和特异性等方面都优于标准PCR和其他传统核酸检测方法，使其成为许多实验室应用的理想平台。

1. 高定量范围

qPCR可以测量超过或等于5个对数单位的核酸量。它可以检测少于5个拷贝的目标分子，甚至在某些情况下可以检测到单拷贝。这对于处理有限样本特别有帮助，例如临床活检或激光捕获显微切割裂解物。当与合适的内部控制和计算程序配对时，qPCR可以保证高度可重复的结果，精度低至1-2%，使其适合分析基因表达的微小变化。

2. 实时监测

与传统PCR在扩增平台期进行定量不同，qPCR在指数期实时监测扩增。这种定量方法通过实时连续监测PCR过程，最小化了平台效应和检测波动的问题。

3. 快速通量

整个过程，从扩增到封闭反应的分析，消除了扩增后的操作，如凝胶电泳。这大大减少了工作量、时间，并降低了交叉污染的风险。传统PCR技术需要通过凝胶电泳或探针杂交来识别感兴趣的产品，因此耗时较长，自动化程度较低，特异性也低于qPCR。

4. 高通量应用

qPCR系统训练更快，适用于高通量应用，因此适合当今的实验室。qPCR允许实时可视化每个循环中特定产物的积累，使技术独立于外部检测方法，减少错误，理想地提高整体效率。

实时PCR在各个领域的应用

1. 生物医学研究

• 基因表达分析：实时PCR是基因表达研究的基石工具，其定量测量mRNA水平的能力使研究人员能够研究不同条件下的基因调控。
• 基因分型模型：用于基因敲除、基因敲入和转基因小鼠模型的基因分型，以了解基因功能和表型。
• 基因敲低和递送：评估细胞培养或动物模型中基因敲低技术和递送方法的效率。
• 单核苷酸多态性（SNP）检测：通过等位基因区分来识别可能使个体易患疾病的SNP，有助于流行病学研究。

2. 分子诊断

• 病毒载量监测：监测病毒载量的变化，帮助测量疾病进展和评估抗病毒治疗。
• 细菌检测：快速准确地识别细菌，如结核分枝杆菌、单核细胞增多性李斯特菌和淋病奈瑟菌，从而实现有针对性的抗生素治疗，减少广谱抗生素的使用。
• 抗生素耐药性监测：通过熔解曲线分析监测病原体如金黄色葡萄球菌和幽门螺杆菌的抗生素耐药性。
• 肿瘤学应用：
• 检测染色体易位和融合基因转录本，有助于检测最小残留疾病（MRD）和监测白血病的疾病进展。
• 确定与恶性肿瘤相关的DNA拷贝数，并使用小样本（如细针抽吸）评估实体瘤中的基因表达。
• 时间和成本效率：提供比传统方法更快的诊断结果（例如，将病原体分析时间从几天缩短到几分钟），具有更高的灵敏度。

3. 食品安全和农业

• 检测食品和农业产品中的转基因生物、微生物和寄生虫。

4. 药物开发

• 基因表达动力学：分析药物治疗对基因表达的影响。
• 药物代谢研究：评估涉及药物分布和消除的转运蛋白和酶的活性。

5. 法医

• 实时PCR的灵敏度和特异性使其非常适合分析刑事调查中的有限或降解样本。

6. 未来展望

• 技术进步：由于微流控、光学和热循环的改进，机器正在变得更快、更便宜、更便携。这将增加全球对实时PCR的可及性。
• 全球可及性：成本降低和便携性将使偏远地区能够应用，支持疾病诊断和流行病学研究。
• 教育：将实时PCR整合到生物教育中可以改善实践学习，鼓励学生追求科学事业。
• 新兴领域：实时PCR有望支持蛋白质组学、代谢组学和转录组学等新兴领域，提供对生物系统的更全面理解。

通过结合精确度、速度和多功能性，实时PCR已成为多个学科的重要工具，持续的技术进步预示着更广泛的应用前景。

实时PCR的工作原理

实时PCR（qPCR）分析通常使用扩增图表示，其中x轴表示PCR循环次数，y轴显示扩增反应发出的荧光，这与扩增产物的数量相关。

扩增图可以分为两个主要阶段：指数期和平台期。在指数期，PCR产物大约每轮循环翻倍。然而，随着反应的进行，反应成分（如引物、核苷酸和聚合酶）开始耗尽。当一个或多个这些成分变得有限时，反应速度减慢并进入平台期，通常在28-40轮循环之间。

在反应开始时，荧光保持在背景水平，尽管PCR产物呈指数级积累（通常在1-18轮循环期间）。最终，积累足够的产物使荧光信号变得可检测。荧光超过背景的点被称为定量循环（Cq）。由于Cq发生在指数期，此时试剂仍然充足，因此可以根据已知的指数动力学准确可靠地估计反应中初始模板DNA或RNA的数量。

Cq值主要受初始模板浓度的影响。反应开始时模板量高意味着需要较少的循环来产生可检测的荧光信号，导致Cq值低或早。相反，初始模板浓度低需要更多的循环才能达到可检测的荧光，导致Cq值高或晚。这种模板浓度与Cq的关系是实时PCR定量的基础。

RNA隔离过程

样本收集

为了准确量化基因表达，收集尽可能同质的样本至关重要。如果样本包含不同类型的细胞，识别目标基因的表达模式可能会很困难。对于异质样本，可以采用组织解剖、针头活检或激光捕获显微切割等方法来分离特定的细胞类型。收集的细胞可用于RNA提取。

RNA提取

对于实时RT-qPCR，通常使用总RNA或poly(A+) RNA。在处理RNA时，防止样本降解是主要考虑因素。市场上有RNase-free的溶液，或者可以使用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理溶液并进行高压灭菌以消除RNases。实验室设备也可以用DEPC处理或在250°C下烘烤3小时以灭活残留的RNases。

在准备RNA样本时，可能需要进行DNase处理以去除任何基因组DNA污染，因为其存在可能导致mRNA数量的高估。然而，如果RNA样本有限，DNase处理应谨慎进行，因为它可能导致RNA的损失。为了避免基因组DNA的扩增，设计引物时需要确保其特异性针对转录本，例如跨越剪接位点的引物。

核酸量和质量分析

准确量化核酸对于基因表达分析至关重要，尤其是在使用RNA量来标准化目标基因表达水平时。RNA浓度和纯度通常通过测量260 nm和280 nm处的紫外吸光度比值来评估。这个比率有助于确定RNA样本的质量和数量，以便进行进一步分析。

总结来说，实时PCR（qPCR）通过提供实时监测扩增的能力，彻底改变了分子生物学领域，为基因表达水平的精确测量提供了可能，从而为生物过程提供了详细的见解。这项技术的关键在于定量循环（Cq）与初始模板浓度之间的关系，提供了评估目标核酸丰度的可靠方式。

为了确保实时PCR实验的成功，正确的RNA隔离、处理和污染预防是至关重要的步骤。通过适当的样本收集、RNA提取和质量控制，研究人员可以获得高度可重复和准确的结果。实时PCR的灵敏度和多功能性使其成为从基因表达分析到诊断等多个领域的不可或缺的工具，最终推动了生物医学研究、临床诊断和治疗开发的进步。