利用尺寸排阻色谱法（SEC）进行符合USP规定的抗体药物分析
利用尺寸排阻色谱法（SEC）进行符合USP规定的抗体药物分析
蛋白质在生产和储存过程中容易因温度、pH及浓度的变化而发生聚集。聚集会影响如单克隆抗体（mAbs）等蛋白质产品的安全性和有效性，因此需要通过专用的分析程序对产品的聚集程度进行确认，而尺寸排阻色谱法（SEC）是一种可用于确认聚集的方法。在USP NF2022通则<129>中描述了使用SEC分析单克隆抗体中杂质的方法。由于该方法采用高浓度盐洗脱液，这可能会导致仪器因为沉淀和腐蚀而损坏，因此本文介绍了采用生物惰性高效液相色谱仪Nexera lite inert系统进行USP合规的单克隆IgG抗体SEC分析，此系统比使用不锈钢部件的HPLC更耐盐和酸。
Nexera lite inert系统优势
- 优异的灵敏度和回收率——更大限度降低因金属吸附而造成的损失
- 出色的耐受性和分离度——轻松应对高盐浓度和极端pH流动相的挑战
- 更高的可靠性和重现性——避免金属管路对化合物的吸附
应用
前处理
样品：通过向2mg单克隆IgG抗体标准品中加入200μL的洗脱液，制备测试样品，使其浓度达到10mg/mL，进行分析。
分析条件
- 色谱柱 ：TSKgel G3000 SWXL（300mm×7.8mm I.D.，5μm）
- 洗脱液 ：200mmol/L磷酸钾缓冲液（含250mmol/L氯化钾水溶液，pH=6.2）
- 流速 ：0.5mL/min
- 柱温 ：25℃
- 进样量 ：25μL
- 检测器 ：UV，280nm
实验结果
① 校准曲线及色谱图：图中显示了单克隆IgG抗体标准溶液（10mg/mL）色谱图（黑色）和校准曲线（蓝色）。色谱图中四个色谱峰的洗脱顺序符合USP中规定的各色谱峰洗脱要求。校准曲线分子量范围为13.7kDa~500kDa。
单克隆IgG抗体标准溶液（10mg/mL）色谱图（黑色）和校准曲线（蓝色）
② 峰面积：采用面积归一化法对各峰面积进行分析。高分子量（聚合物+二聚体）峰面积为0.53%，单体峰面积为99.4%，小分子碎片峰面积为0.04%，均符合USP规定中对物质峰面积的系统适应性规定。
峰面积结果
③ 重现性：对单克隆IgG抗体标准品连续6次进样分析，保留时间重现性RSD为0.03%，峰面积重现性RSD为0.01%，重现性良好。
保留时间及峰面积结果（n=6）
结论
采用Nexera lite inert系统进行符合USP规定的单克隆IgG抗体的SEC分析。分析结果表明各项指标均符合USP规定中对系统适应性的要求。峰面积重现性RSD为0.01%，保留时间重现性RSD为0.03%，表明在高浓度盐洗脱液条件下，Nexera lite inert系统仍然提供良好的分析重现性，有助于抗体药物的分析。
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