活性氧(ROS)检测方法之DCFH-DA荧光探针法
活性氧(ROS)检测方法之DCFH-DA荧光探针法
活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)是一类在生命活动中起重要作用的含氧活性分子，包括超氧阴离子(O₂⁻)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(·OH)等。它们在低浓度时作为信号分子参与正常的生理过程，而在高浓度时则会导致氧化应激，引发细胞损伤甚至死亡。因此，准确检测ROS的水平对于理解细胞信号传导和疾病机制至关重要。
DCFH-DA(二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯)本身无荧光，可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的酯酶水解，形成DCFH，DCFH无荧光且不能通透细胞膜，从而被细胞内的活性氧氧化生成有荧光的DCF。根据活细胞中荧光的产生，可以判断细胞活性氧的含量和变化。
实验步骤
细胞准备：
· 根据不同的细胞类型选择合适的细胞培养板进行接种和培养。
· 检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞密度达到50%~70%，或细胞数量小于5×10^5/mL。
阳性对照(可选)：
· 将阳性对照样品(如Rosup)稀释为1:1000，提前30~60分钟加入培养基中，于37°C避光条件下孵育。
· 对于刺激时间较短的细胞，先进行探针装载，再用活性氧阳性对照物(Rosup)或目标药物刺激细胞。
· 对于刺激时间较长的细胞，先用活性氧阳性对照物(Rosup)或目标药物刺激细胞，再进行探针装载。
工作液配制：
· 将DCFH-DA工作液以1:1000或1:500的比例稀释于无血清细胞培养基或缓冲液(例如PBS)中，使其终浓度为10μM。
细胞染色：
· 先用PBS洗涤细胞以去除细胞内药物残留。
· 加入稀释后的探针，在37°C的细胞培养箱内避光孵育20~30分钟。
· 也可选择在收集细胞后装载探针。
细胞清洗：
· 使用无血清细胞培养基对细胞进行1~2次洗涤，确保完全去除未进入细胞内的染料。
ROS检测：
· 对贴壁生长细胞，可直接在荧光显微镜下观察;对悬浮生长细胞，取适量细胞悬液滴到显微载玻片上，再盖上盖玻片观察。
· 荧光显微镜下，选用FITC滤光片观察荧光，去除背景观察荧光的变化。
· 还可使用流式细胞仪进行检测。选择流式细胞仪FL1或BL1通道，488nm激发，测定530nm的发射信号。DCF的荧光光谱与FITC非常相似，可以使用FITC的参数设置来检测DCF。
· 也可使用荧光分光光度计、荧光酶标仪等进行检测。