微生物检测实验操作指南：从样品处理到结果判定

微生物检测实验操作指南：从样品处理到结果判定

微生物检测是食品安全和质量控制的重要环节。本文详细介绍了从样品前处理到最终计数判定的全过程，包括抽样要求、样品解冻、实验准备、取样方法、稀释技巧、接种方法、培养条件以及结果判定等关键步骤。本文适合实验室工作人员、食品行业从业者以及对微生物检测感兴趣的读者参考学习。

样品前处理

1. 抽样要求：无论何种抽样方案，均要求样品有代表性。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。

2. 样品储存：

• 冷冻样品按要求冷冻保藏
• 干燥食品可放在常温冷暗处
• 易腐和冷藏样品应放入10℃环境
• 冷冻样品来不及检验应放入-15℃以下冰箱内
• 待检样品存放时间不应超过36h

3. 样品解冻：

• 在0-8℃的冰箱中解冻，时间不超过18小时
• 或在温度不超过45℃环境中解冻，时间不超过15min

4. 检测前准备：

• 实验前将工器具移到无菌间，最好用紫外线照射20min分钟灭菌消毒，达到无菌状态
• 准备物品：均质杯、酒精及酒精棉、移液器、灭菌枪头、平皿、稀释液、剪刀、镊子、无菌盆或筐等
• 检查物品是否齐全

检测

1. 样品标识：

• 菌落总数按照GB4789.2操作，每一个稀释度做两个平行，一般做三个稀释度
• 大肠菌群及金黄色葡萄球菌按照4789.3和4789.10中的MPN法检测，每个稀释度3根管，一般也是做3个稀释度

2. 取样：

• 固体样品：75%酒精棉消毒开启部位，火焰灭菌剪刀取样，称取25g有代表性样品，加入225ml灭菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水，8000转均质1-2min
• 液体样品：冷冻样品完全解冻后使用，75%酒精棉消毒开启部位，用火焰灭菌的剪刀开启，用灭菌吸管取充分混合后样25ml，加入225ml灭菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水混匀
• 粉末状样品及半固体样品：混合均匀后取样，加入90ml灭菌磷酸盐缓冲液，开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次

稀释方法

1. 从均质杯准确吸取样液1mL混匀的样液，然后沿管壁徐徐接种到含9ml磷酸盐缓冲液里，盖上试管塞后充分震荡混匀为1：100稀释液
2. 重复该操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀释液
3. 每一稀释液应充分振摇，每一稀释度应更换一个枪头
4. 不要在稀释剂中吹洗吸管

样液接种方法

1. 在无菌室，取出灭菌的枪头或者灭菌的移液器
2. 准确吸取样品匀液，1mL、1mL、1mL无菌操作分别以2～4s内完全注入已标识清楚的菌落总数平皿、大肠菌群以及金黄色葡萄球菌培养液中
3. 如果某一样品液在接种前放置时间超过3 min，应重新均质
4. 为了验证稀释液、培养基、平皿、枪头等器具无菌需做空白对照

倾注培养基

1. 右手持培养基三角瓶（已放46℃的水浴中恒温）置火焰旁边
2. 用左手拇指和食指或中指使平皿开启不超过30°
3. 迅速倒人培养基约15-20ml，加盖后轻轻摇动培养皿，左三圈，右三圈，使培养基均匀分布在培养皿底部
4. 然后平置于桌面

培养

1. 平皿倒置放入恒温培养箱中(每垛最多堆放6个平皿，平皿间要留有空隙进行空气流通)
2. 斜面、高层斜面、液体培养基立在试管架上放入恒温培养箱中
3. 按所规定的时间温度进行培养

计数判定及注意事项

1. 由于细菌种类繁多，差别甚大。计数时一般用菌落计数器仔细观察。必要时用放大镜检查，以防遗漏尤其是平皿边缘生长的菌落
2. 计数方法参照GB 4789.2-2022方法
3. 稀释度低的培养皿，微生物菌落和食品碎渣很难区分，一般吸取过滤网过滤后的稀释液以减少食品碎渣的影响
4. 为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察
5. 必要时，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在平板计数琼脂中加入氯化三苯四氮唑TTC（100ml加入1ml 0.5%TTC），培养后菌落呈红色，易于分别
6. 在发酵试验中，发酵倒管的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡，或发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡，都应作进一步试验
7. 如果对产酸但未产气的发酵有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，就像啤酒中的二氧化碳气泡一样，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验

本文原文来自环凯，转载自“食品微生物检测”公众号，原作者hhy，内容版权归原作者所有。