一文揭秘！绿色荧光蛋白的前世今生

一文揭秘！绿色荧光蛋白的前世今生

说起绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP），科研工作者一定不陌生。GFP是一种具有自发荧光的蛋白质，现已被广泛应用于生物学研究、成像、分子生物学及生物医学等多个领域。关于GFP的历史最早可以追溯到1962年。

图1 海葵（Aequorea Victoria）

GFP的发现

GFP最初来源于海葵（Aequorea victoria）的组织，1988年由Osamu Shimomura研究团队首次发现并鉴定出来，随后由Martin Chalfie和Roger Y. Tsien等科学家对其进行了深入的研究。但GFP真正的“科研之路”却是开启于1994年2月11日出版的《Science》杂志。这一期的封面图片展示了秀丽隐杆线虫的绿色发光的感觉神经元，一经发表即被认为是细胞生物学的一个重大突破。

图2 Science杂志封面展示GFP修饰的秀丽隐杆线虫

虽然这张图对于见过了各种“花式”荧光标记的科研工作者来说稀疏平常，但这却是荧光蛋白应用的开端。从此，GFP及其他后续发现的荧光蛋白，作为当代生物科学中至关重要的工具之一，已辅助科学家发展出多种方法来观察曾经“不可见”的过程。

GFP的结构

GFP是一种直径约为3.2纳米的蛋白质，由238个氨基酸残基组成。荧光的产生主要就依赖于GFP蛋白质内部的三个氨基酸残基（丝氨酸、天冬氨酸和酪氨酸）形成的花环结构。当紫外光（395-470nm）照射到GFP分子上时，花环结构通过共轭共振的方式将紫外光能量转化为绿色荧光。对GFP的激发光谱在395nm附近（紫外）和470nm附近（蓝光）分别有一个主激发峰和一个次激发峰，而发射光谱在509nm附近（绿光）和540nm附近（侧峰）分别有发射峰。值得注意的是，虽然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于该激发光对细胞的伤害更小，因此通常多使用该波段光源（多为488nm）。

图3 GFP的晶体结构

GFP的变体

虽然GFP应用广泛，但仍然存在一些局限，如较低的亮度、荧光强度等。为了更好地进行研究，科学家们还陆续研发出了多种GFP变体。这些变种荧光蛋白的荧光颜色、发射波长和荧光强度不同，可以应用于多光子显微镜、荧光共振能量转移（FRET）和荧光激活子（FACS）等技术中，进一步拓展了GFP在生物学研究中的应用范围。

EGFP

应用最为广泛的红移变体是1994年被发现的GFP单点突变体：GFP-S65T，其第65位由Ser突变为Thr。研究者发现，相比野生型，GFP-S65T的发光强度和光稳定性都要好得多。另外相比野生型GFP在395nm和475nm的两个主要的激发峰，GFP-S65T仅有一个在484nm的激发峰。GFP-S65T的发射波长也被保持在509nm，它的光谱特性几乎符合经典的FITC荧光特性（FITCex：496nm，FITCem：520-530nm）。这种GFP突变体，因其荧光比野生型GFP亮很多倍，因此也被称为增强型GFP，即EGFP。

图4 EGFP的应用

dEGFP

在应用过程中，科学家们发现野生型GFP和EGFP以及其他多数突变体的半衰期较长，不适用于一些需要精确追踪表达的减少和损耗的研究。因此，科学家在1998年构建了另一种突变体：不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）。这种突变的原理是：小鼠的鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）包含一个PEST序列，这个序列有促进蛋白在细胞中降解的功能，这种突变的dEGFP就是将EGFP的cDNA序列融合到ODC基因的C-末端，使其可以被PEST降解，有利于实时追踪基因表达动力学的研究。

多彩荧光

在很多研究中，只有一种荧光颜色是不能满足研究需求的，因此科学家们还研究了不同颜色的荧光蛋白。

• 黄色突变体：增强型黄色荧光蛋白EYFP，在使GFP的四个氨基酸发生突变后，EYFP的发射光变成黄绿色，且荧光亮度与EGFP相似。目前应用广泛的黄色荧光蛋白mCitrine和mVenus就是在EYFP基础上改进的突变体。

• 蓝色突变体：增强型蓝色荧光蛋白EBFP，在使GFP的四个氨基酸发生突变后，EBFP的激发波长为380nm，发射波长为440nm。由于EBFP发光较为微弱，因此针对其研发出了3个更亮的荧光突变体：Azurite、EBFP2和mTagBFP。

• 青色突变体：增强型青色荧光蛋白ECFP，在使GFP六个氨基酸发生突变后，ECFP的激发波长有433nm和453nm主次两个激发峰，发射波长在475nm和510nm两峰。

图2 不同海葵个体及其中纯化的荧光蛋白

GFP的应用

GFP化学性质稳定，可以耐受高温、强酸和强碱等极端条件下的处理，适用于多种实验条件。GFP的荧光信号可以直接在活细胞或活体中观察，无光漂白现象，荧光性质不会被甲醛固定、石蜡包埋所影响。

在生物学研究中，GFP被广泛应用于基因表达、蛋白质定位和相互作用、细胞追踪和标记、疾病模型研究等方面。通过将GFP融合到目标蛋白的编码基因上，可以实现对该蛋白的表达和定位的实时监测。此外，通过改变GFP分子的结构和染色体位置，还可以实现对蛋白质相互作用、结构和功能的研究。例如，研究人员可以将GFP标记到特定细胞或组织中，观察其在发育、疾病和治疗过程中的动态变化。

图1 EGFP在小鼠不同组织中的表达

总之，绿色荧光蛋白（GFP）是一种具有自发荧光的蛋白质，在生物学研究和生物医学领域中发挥着重要的作用。它的独特性质使其成为一种理想的标记物和成像试剂，为我们深入了解生物过程和疾病机制提供了有力的工具。

参考文献

1. Ssblakely, via Wikimedia Commons Ssblakely, via Wikimedia Commons.

2. Remington S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein science : a publication of the Protein Society.2011. 20(9), 1509–1519.

3. Craggs T. D. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Chemical Society reviews. 2009. 38(10), 2865–2875.

4. Elliott KL, Kersigo J, Lee JH, Jahan I, Pavlinkova G, Fritzsch B, Yamoah EN. Developmental Changes in Peripherin-eGFP Expression in Spiral Ganglion Neurons. Front Cell Neurosci. 2021. 15:678113.

5. Lambert GG, Depernet H, Gotthard G, Schultz DT, Navizet I, Lambert T, Adams SR, Torreblanca-Zanca A, Chu M, Bindels DS, Levesque V, Nero Moffatt J, Salih A, Royant A, Shaner NC. Aequorea's secrets revealed: New fluorescent proteins with unique properties for bioimaging and biosensing. PLoS Biol. 2020. 18(11):e3000936.