鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒双重实时荧光定量PCR检测方法
鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒双重实时荧光定量PCR检测方法
本发明属于分子生物学，尤其是涉及基于Taqman探针法的一种鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒双重实时荧光定量PCR检测引物组合与检测方法。
背景技术
鳗鲡（Anguilla）俗称鳗鱼，肉质鲜美，营养价值高，是全球重要的经济鱼类。在我国，鳗鲡产业已形成集种苗培育、养殖、饲料、产品加工以及出口销售等较为完整和成熟的产业链。但是，在目前集约化养殖过程中，鳗鲡病毒性疾病的流行与爆发，给从业者造成巨大经济损失，阻碍鳗鲡产业的健康发展。特别是近些年流行的鳗鲡疱疹病毒（AngHV）和圆环病毒（EECV）逐渐引起大家的关注。
鳗鲡疱疹病毒（AngHV）是一种具有囊膜的线性双链DNA病毒，属于鱼蛙疱疹病毒亚科（Alloherpesviridae），鲤鱼疱疹病毒属（Cyprinivirus）。其基因组全长248kb，含136个开放阅读框，与其他鱼蛙源疱疹病毒亚科的序列同源性仅有19％～58％。AngHV是鳗鲡的一种重要病毒性病原，可引起鳗鲡“烂鳃”、“脱粘”、“红头”、“脱黏败血综合征”典型症状，传染性强，死亡率高，给养殖者造成巨大的经济损失。
鳗鲡圆环病毒（EECV）则是一种小型的、无囊膜的环状单链DNA病毒，其结构为二十面体病毒粒子，直径大小为12～26nm。EECV基因组大小约为1.7～2.3kb，有一个双义的基因组，包含两个主要的开放阅读框，以相反的方向排列，编码复制启动蛋白和衣壳蛋白。EECV可导致鳗鲡体表出现乳突状瘤，鳃部溃烂，头、腹部颜色发红，肝脏、脾脏肿胀发黑，还有可能导致机体急性死亡及引发其他病原二次感染或共同感染。同时该病毒可长期潜伏在鳗鲡体内，研究表明表观健康鳗鲡的不同脏器中，圆环病毒的检出率约为35.5％～40.6％。
随着分子生物学检测技术发展，普通PCR技术由于易引起实验室污染，无法定量等缺点，正在逐步被实时荧光定量PCR（qPCR）所取代。现有技术建立了基于Taqman探针和SYBR Green的单重qPCR检测方法，实现对鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒的进行快速定量检测。但目前的研究仅针对单一的鳗鲡疱疹病毒或鳗鲡圆环病毒建立qPCR检测方法，尚未见有关鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒的双重qPCR的检测技术及试剂盒等相关技术专利。
由于鳗鲡疱疹与圆环病毒鳗鲡均具有潜伏感染的特性，且临床症状非常相似，肉眼较难分辨，一旦爆发则发病快、死亡率高，且尚无有效的治疗方法。因此亟需建立一种快速、简便且能够同时检测这两种常见鳗鲡病毒性疾病的检测方法，为其流行病学调查及防控提供技术基础。
技术实现思路
本发明的第一目的在于提供一种基于Taqman探针的双重定量检测鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒的特异性引物探针组合，可实现同时、快速、定量检测鳗鲡组织和细胞样品中鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点。
本发明的第二目的在于提供一种鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒双重实时荧光定量PCR检测方法。
本发明的第三目的在于提供所述特异性引物组成在制备荧光定量PCR试剂盒中的应用。
本发明提供一种基于Taqman探针的双重定量检测鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒的特异性引物探针组合，所述引物探针组合针对的靶标基因为鳗鲡疱疹病毒的DNA聚合酶（Pol）和圆环病毒的衣壳蛋白基因（CP），所述引物探针组合的核酸序列如下：
- AngHV-Pol-QF: 5ˊ-AGGCCGAGAACCTCTACACC-3ˊ
- AngHV-Pol-QR: 5ˊ-GCTCTTGGCCGTCTTCATGT-3ˊ
- AngHV-Pol-QProbe: 5ˊ-FAM-TTCCAGCCTCCGCCACTACCTGAGCAT-BHQ1-3ˊ
- EECV-CP-QF: 5ˊ-GGTGTTTGCTGTGTTTGGCA-3ˊ
- EECV-CP-QR: 5ˊ-GAGGAAGAGCAACAGGCGAC-3ˊ
- EECV-CP-QProbe: 5ˊ-VIC-ACGGTATCGGCGCTGGCAATTCCTGA-BHQ1-3ˊ
其中，FAM和VIC为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。
所述引物探针组合可用于同时检测疑似鳗鲡疱疹病毒、圆环病毒感染样品或混合感染样品。
检测方法
本发明提供鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，所述方法的具体步骤为：
针对靶标基因为鳗鲡疱疹病毒的DNA聚合酶（Pol）和圆环病毒的衣壳蛋白基因（CP）设计特异性引物组合，双重qPCR扩增筛选特异性引物组合，所述特异性引物组合的序列如序列表所示；
制备阳性标准质粒模板；
基于步骤1所述特异性引物组合建立Taqman双重qPCR反应体系与反应程序，进行扩增反应；
建立Taqman双重qPCR体系标准曲线；
通过CT值进行检测结果的判断。
在步骤3中，所述Taqman双重qPCR反应体系为：体积15～50μl，上下游引物与探针引物浓度比为1︰1～5︰1；上下游引物（10μmol/l）0.1～1.2μl，探针（10μmol/l）0.1～0.4μl。
优选的反应体系为：体积20μl，2×Taqman Fast qPCR预混液10.0μl，特异性上下游引物（10μmol/l）为0.1～0.8μl，探针引物（10μmol/l）为0.1～0.4μl，模板1.0μl，用ddH2O补充至20.0μl；
扩增反应采用双重实时荧光定量PCR扩增技术的反应程序：预变性95℃3～15min，95℃15～60s，退火温度58～62℃，退火时间10～60s，并收集荧光信号，设置40个循环。
在步骤4中，所述建立Taqman双重qPCR体系标准曲线的具体步骤可为：
将阳性质粒标准品按10倍比稀释为6.2×107～6.2×101拷贝/μl等7个浓度梯度，作为模板，以鳗鲡疱疹病毒的DNA聚合酶（Pol）和圆环病毒的衣壳蛋白基因（CP）的特异性引物探针组合进行双重qPCR反应，以模板拷贝数的对数为横坐标，对应的最低循环阈值CT值为纵坐标，制作标准曲线，AngHV和EECV靶基因的标准曲线回归方程分别为YangHV＝-3.516x+41.216和YeECV＝-3.505x+40.87。
在步骤5中，所述通过CT值进行检测结果的判断，具体步骤可为：
（1）将样品DNA稀释至标准曲线范围内，以鳗鲡疱疹病毒的DNA聚合酶（Pol）和圆环病毒的衣壳蛋白基因（CP）的特异性引物探针组合为引物，进行双重qPCR反应，得到样品循环数CT值，根据上述标准曲线回归方程计算样品中病毒拷贝数；
（2）结果判定：CT值≤33时，报告为阳性；33＜CT值≤36时，样本重新检测，复检时做3个重复反应，若2或3个重复反应的33＜CT值≤36，且出现典型的扩增曲线，则进一步结合测序分析进行结果判定；CT值＞36时，或无典型“S”形扩增曲线，报告为阴性。
本发明还提供所述特异性引物和探针在制备荧光定量PCR试剂盒中的应用，所述试剂盒用于定量检测鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒，在检测疑似鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒感染样品或混合感染中的应用。
所述试剂盒还包含上述引物对、含有鳗鲡疱疹病毒的DNA聚合酶和圆环病毒的衣壳蛋白基因阳性质粒标准品（浓度为6.2×108copies/μl）、阴性对照品（灭菌双蒸水）、2x Taqman Fast qPCR预混液等。
该试剂盒灵敏性高，是普通PCR的100倍；特异性强，对引起鳗鲡相似病症常见气单胞菌，及水产动物其他常见病毒和阴性对照均无阳性扩增结果；重复性好，组内CT值变异系数（CV％）均小于3％；通量高，时间快，与单重qPCR相比，该试剂盒可在相同时间内、同一qPCR反应体系中同时定性和定量检测鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒两种病毒。
本发明对疑似样品的阳性检出率明显高于普通PCR，为快速、准确的定量检测样品中鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒的数量提供新的检测方法，可应用于鳗鲡疱疹病毒病和圆环病的检测和流行病学研究。
本发明分别以鳗鲡疱疹病毒的DNA聚合酶（DNA Polymerase）和圆环病毒的衣壳蛋白（Capsid Protein）的高度保守区域设计基于Taqman探针的双重qPCR检测技术，通过优化特异性引物与探针引物浓度比、反应时间和反应温度等条件，研发双重qPCR快速检测试剂盒，实现了全封闭检测无污染、扩增实时可定量、同一个反应体系里同时扩增两种病毒，可实现对潜伏期疑似病样的快速、准确定量检测，提高无症状鳗鲡中鳗鲡疱疹病毒、圆环病毒的检出率，对生产中鳗鲡病毒性疾病的防控具有重要意义，可支撑鳗鲡产业的健康可持续发展。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点和技术效果：
本发明提供了基于Taqman探针的双重实时荧光定量PCR，该方法可以在30～60min内完成核酸扩增，通过标准曲线和CT值实现靶基因的检测和定量，无需像普通PCR检测一样，扩增结束后开盖进行电泳检测等，从而避免扩增产物的实验室污染等问题，大大缩短样品检测时间和复杂程度。
本发明提供双重时荧光定量PCR检测方法特异性强：对引起鳗鲡相似病症常见气单胞菌，及水产动物其他常见病毒均无阳性扩增结果。
本发明提供的双重时荧光定量PCR检测方法灵敏度高，AngHV和CV的最低检测浓度为62copies/μl。
本发明提供双重时荧光定量PCR检测方法通量高，与单重qPCR相比，该试剂盒可在相同时间内、同一qPCR反应体系中同时检测鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒两种病毒，大大提高检测效率。
本发明提供的定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒可应用于检测疑似鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒感染样品或混合感染，对疑似样品的阳性检出率明显高于普通PCR，为快速、准确的定量检测样品中鳗鲡疱疹病毒和圆环病毒的数量提供新的检测方法，可应用于鳗鲡疱疹病毒病和圆环病的诊断和流行病学研究。