微生物的分离培养方法、操作步骤及注意事项——划线分离法、涂布平板法

微生物的分离培养方法、操作步骤及注意事项——划线分离法、涂布平板法

微生物的分离培养是微生物学实验中的基础技术，掌握正确的分离方法对于获得纯净的单菌落至关重要。本文将详细介绍两种常用的微生物分离培养方法：划线分离法和涂布平板法，包括其操作步骤、技巧和注意事项，帮助读者从实验室新手成长为分离培养的专家。

划线分离法

定义

划线分离法是利用接种环将目标菌种在固体培养基表面划线，通过逐步稀释菌种，使培养后能够长出许多单一菌落，从而达到菌种分离纯化的目的。

目的

获得纯化的单菌落，越多越好。

操作步骤

1. 取菌种：取出目标菌种，融化后备用。
2. 接种针灭菌：灼烧接种针进行灭菌。
3. 接种针冷却：将接种针移至酒精灯旁边冷却。
4. 蘸取菌种：甘油管用75%酒精消毒，待酒精挥发完全，在酒精灯火焰略微灭菌（防止烤糊），然后用接种环蘸取一环菌种。
5. 划线：取已经备好的固体平板，边转动平板边用酒精灯火焰灭菌，打开平板（靠口朝酒精灯），用上述接种环在平板上划线，先在一侧连续划线3-4次，边转动平板边用酒精灯灼烧接种环，冷却后，用接种环穿过第一次划线部分继续划线3-4次，同样方法进行第三次划线，或第四次划线（根据菌液浓度和菌种类型确定划线次数），灼烧接种环。
6. 标记：在平板底部边缘处标记菌种名称，日期和其他信息。
7. 培养：放置于恒温培养箱中培养。
8. 保存：待培养完成后保存于4℃冰箱，待用。

操作技巧

1. 甘油管菌种取出后，尽量不要放回去，或者标记清楚，反复冻融菌种效果不好。
2. 灼烧接种针时，一定要烧红！要烧红！要烧红！重要的事情说三遍，不烧红灭菌不彻底，容易污染，也可能出不来单菌落。
3. 烧红的接种针一定要冷却后再使用，如何确定接种针是否冷却？用接种针沿着固体培养基内侧边缘或不可能用到的区域“轻点”，试一下固体培养基是否能够融化，如果融化，说明温度过高，继续冷却；如果不融化，说明接种针已经冷却，可以使用。
   
4. 甘油管菌种的浓度直接影响到划线区域的分布，如何确定甘油管菌种浓度？

• 第一种方法，事先查阅试验记录，确定甘油管菌种浓度。
• 第二种方法，借助显微镜观察，粗略判断甘油管菌种浓度。
• 第三种方法，测量吸光度，推测甘油管菌种浓度。

5. 划线过程，要求扫尾，扫尾出单菌落效果良好。但是，在实际操作中，很少人扫尾，因为有时候看不清尾部在哪，直接在附近区域划线，效果也不错。
6. 一定要标记清楚菌种信息和划线日期，一般情况在培养皿底部边缘处标记。

注意事项

1. 除样品外，所有试验都必须在无菌环境下进行，在打扫卫生、实验室消毒过程中，一定要做好个人防护。
2. 试验过程中，一定要正确使用酒精灯，避免着火。
3. 一定要在酒精灯旁边操作。
4. 试验结束一定要将无关物品从超净工作台中取出，该灭菌的物品一定要灭菌后再处理，避免交叉污染。
5. 试验过程中，尽量减少人员流动。
6. 试验过程中，避免手部接触平板边缘，以免造成污染。
7. 试验过程中，如果出现意外，比如说着火，别着急，拿上湿抹布覆盖即可。

涂布平板法

定义

涂布平板法是将待分离微生物样品经过一系列梯度（一般10倍递增）稀释后，使微生物菌体充分分散，成为单细胞，然后再取出一定量，涂布到固体培养基表面的方法，再经过适宜的培养条件，形成单菌落的过程。

目的

1. 获得纯培养物-目标菌。
2. 获得纯培养在微生物杂菌中的数量或比例—平板计数。

操作步骤

梯度稀释步骤：

1. 称量：准确称取待测样品1g或量取待测样品1mL。
2. 稀释：将上述样品放入装有99mL无菌生理盐水（有小玻璃珠）的250mL三角瓶中，记录。
3. 摇匀：将上述三角瓶放置于摇床上振荡30min，使微生物细胞充分分散，静置20-30s，即成10-2稀释液。
4. 继续稀释：再用1mL无菌移液器，吸取上述稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液和水混合均匀，即成10-3稀释液。
5. 继续稀释：再换一支无菌移液器，吸取10-3稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，即成10-4稀释液。
6. 继续稀释：以此类推，连续梯度稀释，制成10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。

涂布平板步骤：

1. 标记：将事先制备好的无菌平板上标记10-7、10-8、10-9，每一个梯度稀释设置三个重复。
2. 涂布：用无菌移液器分别吸取10-7稀释液0.1mL放入编号10-7的3个平板中，然后用涂布棒或涂布器将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个涂布器，用完涂布器酒精灯灼烧灭菌。
3. 继续涂布：同样涂布10-8稀释液和10-9稀释液，切记更换涂布棒。
4. 培养：将涂布好的平板平放于超净台上静置10min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板放置于恒温培养箱中倒置培养。
5. 计数：至长出菌落后即可计数。
6. 保存：将单菌落平板储存至4℃保存。

计数原则：

1. 计数原则，平板上菌落数30-300个为合格。
2. 如果只有一个稀释度的平均菌落数，则以该稀释度平均菌落数除以涂布平板所用稀释液体积(0.1mL)，乘以稀释倍数作为该样品的细菌总数。
3. 如果有两个稀释度的平均菌落数符合要求，则按照两者菌落总数之比来决定，如果小于2，取两者的平均值如果大于2，取较小的菌落总数。

操作技巧

1. 前几个稀释梯度，尤其是第一个梯度适当放大稀释倍数。这样不容易丢失目标菌，也可以很好地对样品进行溶解。
2. 学会使用玻璃珠。玻璃珠的作用是研磨，尤其是粉末或颗粒性样品，可以将颗粒表面微生物与液体充分接触。
3. 勤换枪头或移液管。这样不容易造成不同稀释度间混乱，防止不同梯度间取样不准。
4. 一定要摇匀。平板涂布法的难点就在于稀释，稀释不准确后面一切都化为零，一定要摇匀再取样。
5. 利用显微镜粗略估测稀释倍数。并不是每一个样品都需要稀释到10-9，而是要根据样品中微生物的数量进行稀释。
6. 涂布完成后，静置10min再倒置培养。静置有利于微生物在培养基表面吸附，直接倒置培养，可能倒置菌液向一侧流动。
7. 倒固体培养基的时候，可以适当吹干或提前一到两天倒平板。平板表面没有多余水分且比较湿润，涂布时候既容易涂开也不会造成出现菌苔。

注意事项

1. 注意涂布力度，大小适宜，不应划破培养基的表面。
2. 如果发现平板上水太多，处理后再使用。
3. 切记写清楚标记。
4. 试验完毕，注意灼烧涂布器，以免影响环境，造成交叉污染。