无菌产品的D值研究——开发灭菌工艺的关键工具
无菌产品的D值研究——开发灭菌工艺的关键工具
在生物医药和医疗器械领域，确保产品的无菌状态是至关重要的。D值研究作为开发灭菌工艺的关键工具，对于确定合适的灭菌参数具有重要意义。本文将详细介绍D值研究的相关内容及其在实际应用中的重要性。
灭菌的目的是杀死产品中自然存在的微生物污染（生物负载）。常用的灭菌方法有两种：一种是灭菌参数基于被灭菌材料上预先确定的生物负载的类型和浓度的方法（BBS）；另一种是灭菌参数基于主观确定的，高于被灭菌材料生物负载的初始浓度和抗性的过度杀灭法（OS）。
产品的生物负载是什么？
产品中存在的微生物可以是病毒、细菌和真菌，主要有三个来源：生产环境、人员和包括水在内的原材料。有些生物体是产（芽）孢菌类，通常对于包括灭菌过程在内的环境压力最具抗性。根据生产条件和原材料的不同，产品可能不含，或含有少量生物负载，也可能含有高浓度的多种微生物。尽可能多地了解生物负载微生物是非常有必要的，尤其是在确定最小灭菌周期的过程中。生物负载的必要信息有：
- 灭菌前的微生物总数
- 微生物的种类
- 可形成孢子的微生物数量
- 生物负载的抗性
- 采样频率和统计分析
灭菌前产品对生物负载有什么影响？
了解产品对微生物的影响是很重要的，尤其是对液体产品。如果产品能够促进微生物的生长，那么随着时间的推移，少量的微生物最终会大量繁殖。如果在生产和灭菌之间有明显的延迟，就会出现问题：大量的微生物会导致灭菌时间的增加。或者，该材料可以是抑菌、灭菌、抑孢或杀孢的。
被灭菌材料的性质（例如药品的化学成分或医疗器械的物理特性）可对微生物的抗性产生重大影响。产品可以通过多种方式保护微生物，如覆盖或导致微生物聚集，增加它们对灭菌过程的抗性。或者可能使它们更容易受到灭菌过程的影响。
图1显示了单个自由漂浮的孢子，而图2显示了几个大的团块，其中一些包含数百个孢子。
图1 乙醇中未结块的孢子
图2 产品中聚集的孢子
为什么可以根据嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子的抗性来确定灭菌周期？
嗜热脂肪地芽孢杆菌（ATCC # 7953）孢子（在滤纸片上的D值范围通常在1.5 - -2.5分钟）比大多数野生型微生物具有更高的抗性。这些孢子广泛用于监测蒸汽灭菌过程，可在抗性测试中替代生物负载微生物。当用其进行替代时，可以假定嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子比生物负载微生物具有更高的抗性，或特意让其数量远超生物负载微生物。嗜热脂肪地芽孢杆菌的杀灭时间则将超过生物负载微生物的杀灭时间。下面的图表说明了这一点。
是否可以基于其他微生物的抗性建立灭菌周期？
其他微生物如凝结芽孢杆菌（ATCC #7050）、B. smithii芽孢杆菌（以前的凝结芽孢杆菌ATCC #51232）、枯草芽孢杆菌“5230”（ATCC #35021）和生孢梭菌（ATCC #11437）可在某些情况下使用。这些微生物对湿热灭菌比嗜热脂肪地芽孢杆菌更敏感。但总体而言，它们仍然比生物负载抗性更高。当产品对灭菌过程敏感时，可能需要使用这些微生物中的一种，从而限制灭菌时间。然而，当使用热敏性产品时，强烈建议在基于上述微生物的灭菌参数之前对生物负载的特征进行确认。
为什么要进行D值研究？
评估被测试微生物（生物负载分离菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子）抗性的最直接方法是进行D值研究。在评估生物负载时，没有必要测试每一种单独的微生物，测试最具抗性的即可（用热休克法筛选出来的微生物）。
D值研究是如何进行的？
理想情况下，D值研究应该在实际产品中添加测试微生物并使用能够运行方波循环的抗力仪。
D值可以通过残存曲线法或阴性分数法进行计算。残存曲线法绘制了存活的微生物数量与灭菌参数（一般是时间）的关系。该曲线用图形表述了杀灭微生物过程的动力学。阴性分数法有时被称为“终点实验”，主要集中在量变区（暴露后培养，指示剂出现部分阳性和部分阴性结果）。
残存曲线法有两个优点。一是在进行产品测试时可以展示对数线性回归曲线，可以外推来展示计算出的SAL。另一种是产品可以通过过滤去除，以消除对受损孢子的任何潜在产品抑制的影响。Mesa Labs在该方法的运用上有丰富的经验，多年来一直助力于药企在新药研发中的D值研究。
为了进行研究，客户需要提供大约100毫升的产品和含有生物负载分离菌的斜面。如果不需要生物负载研究，Mesa Labs可以提供孢子（可溯源）。典型的研究内容包括：
- 将被测试的微生物接种到产品上
- 将产品密封到非常小的玻璃安瓿中
- 在抗力仪中对安瓿进行间隔暴露
- 分析安瓿中存活的孢子
- 通过这些暴露中收集的数据来计算D值。
这些D值可用于计算灭菌过程中适当的SAL。Mesa Labs还可提供相应的生物指示剂，以实现对灭菌过程的常规监测。