干货分享 | 活性氧 ROS 检测攻略大全！
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活性氧（ROS）是细胞代谢过程中产生的具有强氧化能力的物质，其在低浓度时发挥复杂的信号传导功能，但在高浓度时会对细胞造成损害。本文将为您详细介绍ROS的定义、组成、来源及其检测方法，帮助您更好地理解这一重要生物化学概念。
活性氧（ROS）
【定义】：活性氧（Reactive oxygen species, ROS），是细胞正常代谢的副产物，氧的部分还原代谢产物，是源自O2且比O2本身更活泼的物质的统称[1][2]。
【组成】：ROS不仅包括超氧自由基阴离子(O2•−)和一些其他氧自由基，还包括一些O2的非自由基衍生物，如过氧化氢(H2O2)、次氯酸(HOCl)和过氧亚硝酸盐/过氧亚硝酸(ONOO−/ONOOH)。
【来源】：ROS主要在线粒体中产生，除细胞代谢外，ROS还由特定的质膜氧化酶在生长因子和细胞因子的作用下产生，同时也可通过外部因素（如环境应激、辐射、药物等）引起增加。
图 1. 活性氧的潜在来源[3]
许多酶，包括线粒体电子传递链中的酶、黄嘌呤氧化酶、环氧化酶、脂氧化酶、髓过氧化物酶、细胞色素P450单加氧酶、解偶联NOS、血红素加氧酶、过氧化物酶和NAD(P)H氧化酶，都能产生ROS。根据它们在细胞中的位置，这些ROS可以在细胞内、细胞外或特定的细胞内区室中产生。
为什么要测活性氧（ROS）？
ROS具有强氧化能力，低浓度时发挥复杂的信号传导功能，但在高浓度时对细胞有害。
【氧化应激】：细胞具有一套防御系统来将ROS维持在生理正常水平，即酶促抗氧化剂，负责将自由基转化为稳定的、危害较小的分子。但当细胞产生的ROS超过其抗氧化能力时，可能会对细胞大分子（如脂质、蛋白质和DNA）造成损害，导致氧化应激状态。这种损伤被认为与许多疾病的发展和老化过程相关，包括肺动脉高压、心肌病、糖尿病、帕金森病和癌症等。
举个栗子：
氧化应激在癌症特征（如血管生成、侵袭性、干细胞和转移能力）中起着重要作用：癌细胞是代谢活跃且缺氧的细胞，由于大量生长和血管灌注不足，往往会产生更多的ROS，ROS通过线粒体膜扩散损伤DNA，同时还充当信号转导信使，参与细胞存活、治疗耐药性等。
图 2. 正常细胞和癌细胞中ROS信号传导的概述[4]
【抗氧化剂】：生物学中存在多种抗氧化剂。体内的主要抗氧化剂是酶系统，例如，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)将O2-转化为H2O2、过氧化氢酶作用于H2O2产生H2O和O2、谷胱甘肽过氧化物酶分解H2O2和LOOH等。此外，还有常用作“抗氧化剂”的低分子量化合物如N-acetylcysteine (NAC)等。
活性氧（ROS）的检测
目前针对ROS的检测方法主要有荧光染色法、电子顺磁（自旋）共振技术（Electron paramagnetic (spin) resonance, EPR/ESR）、化学发光法、色谱法、分光光度法、电化学生物传感器和基于荧光蛋白等。
表 1. 检测/定量活性氧的方法（不同环境）[5]
特定ROS检测方法
ROS：O2•-
检测试剂：HKSOX-1，HKSOX-1r，HKSOX-1m
超氧阴离子自由基(O2•-)一直被认为是一种重要的细胞信号分子，参与先天免疫和代谢稳态等多种生理和病理过程。O2•-的异常产生可导致铁硫(Fe-S)蛋白和半胱氨酸硫醇等生物分子的氧化损伤，或直接诱导细菌和哺乳动物细胞死亡。其二次产物，如过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(OH)、过氧亚硝酸盐(ONOO-)和次氯酸(HOCI)，也参与信号转导和多种病理状况。
图 3. 使用HKSOX-1对受精后72h斑马鱼胚胎内源性O2•−共聚焦成像[6]
ROS：H2O2
检测试剂：HKPerox-1，HKPerox-2
H2O2主要由NADPH氧化酶与超氧化物歧化酶、线粒体电子传递链和许多其他酶共同产生，是一种强双电子氧化剂，但其高活化能限制了其对少数生物靶标的反应性。H2O2相对稳定。它与谷胱甘肽、半胱氨酸和蛋氨酸的反应非常缓慢，但根据特定的蛋白质结构和环境，其对特定蛋白质中半胱氨酸的反应活性可大大提高到10 M-1S-1（约为蛋白质中平均半胱氨酸的106倍），为H2O2在氧化还原信号中的选择性和特异性提供了基础。它们在细胞信号传导中起作用，特别是在免疫系统中，并通过铁下垂参与细胞死亡。
图 4. 利用HKPerox探针在活细胞中进行内源性H2O2的分子成像[6]
RAW264.7巨噬细胞与HKPerox-1 (10 mm)和CCl3CN共培养的代表性共聚焦图像。
ROS：•OH
检测试剂：HKPerox-1，HKPerox-2
在所有活性氧ROS中，•OH被认为是最具活性和最有害的一种。它的寿命很短，大约10-9秒，可以与许多生物分子如DNA碱基、脂质和蛋白质以扩散控制的速率发生反应，它的过量产生会导致细胞损伤，并与多种疾病有关。另一方面，越来越多的证据表明，“•OH”和其他ROS的产生可以应用于癌症治疗。因此，监测细胞内•OH对于了解其生物学影响和进一步研究其治疗用途至关重要。
图 5. 共聚焦成像中HKOH-1r对RAW264.7小鼠巨噬细胞内源性•OH的检测[8]
高灵敏度、高选择性的羟基自由基检测探针已经被开发出来。荧光探针HKOH-1已被应用于几种羟基自由基清除剂的抗氧化能力筛选。通过共聚焦成像和流式细胞术，HKOH-1r检测了多种细胞类型中内源性羟基自由基的产生。
ROS：HCLO
检测试剂：HKOCl-3，HKOCl-4，HKOCl-4m
次氯酸和次氯酸盐是细胞内重要的ROS之一，它由H2O2和Cl-通过髓过氧化物酶催化，HOCl可以作为免疫防御系统破坏侵入性细菌，而另一方面，由于致病性氧化应激损伤，它可以引起包括癌症在内的许多疾病。
图 6. 内源性HOCl与HKOCl-4r在RAW264.7小鼠巨噬细胞中的共聚焦荧光成像[9]
ROS：ONOO-
检测试剂：HKYellow-AM (6/12-mixture)、HKGreen-4I
氧化自由基包括活性氧(ROS)和活性氮(RNS)在脑I/R损伤的病理过程中起着至关重要的作用。在脑缺血再灌注阶段，同时产生的一氧化氮(NO)和超氧阴离子(O2•-)以扩散速率迅速形成过氧亚硝酸盐(ONOO-)。ONOO-可以穿透生物膜，甚至具有比O2•-更高的扩散能力。ONOO-通过触发一系列分子级联反应，在介导凋亡细胞死亡、炎症、梗死扩大和血脑屏障破坏中发挥关键作用。
图 7. 内源性ONOO-与HKYellow-AM在SH-SY5Y细胞中的共聚焦荧光成像[10]
参考文献
[1] Thannickal VJ, et al. Reactive oxygen species in cell signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 Dec;279(6):L1005-28.
[2] Arfin S,et al. Oxidative Stress in Cancer Cell Metabolism. Antioxidants (Basel). 2021 Apr 22;10(5):642.
[3] Griendling KK, et al. Oxidative stress and cardiovascular injury: Part I: basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS. Circulation. 2003 Oct 21;108(16):1912-6.
[4] Khan AQ, et al. Reactive oxygen species (ROS) in cancer pathogenesis and therapy: An update on the role of ROS in anticancer action of benzophenanthridine alkaloids. Biomed Pharmacother. 2021 Nov;143:112142.
[5] Murphy MP, et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 2022 Jun;4(6):651-662.
[6] Hu JJ, et al. Fluorescent Probe HKSOX-1 for Imaging and Detection of Endogenous Superoxide in Live Cells and In Vivo. J Am Chem Soc. 2015 Jun 3;137(21):6837-43.
[7] Ye S,et al. Tandem Payne/Dakin Reaction: A New Strategy for Hydrogen Peroxide Detection and Molecular Imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 2018 Aug 6;57(32):10173-10177.
[8] Bai X, et al. HKOH-1: A Highly Sensitive and Selective Fluorescent Probe for Detecting Endogenous Hydroxyl Radicals in Living Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 2017 Oct 9;56(42):12873-12877.
[9] Xiaoyu Bai, et al. HKOCl-4: a rhodol-based yellow fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid in living cells and tissues. Organic Chemistry_Frontiers. Issue 8, 2020.
[10] Feng J,et al. Naringin Attenuates Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury Through Inhibiting Peroxynitrite-Mediated Mitophagy Activation. Mol Neurobiol. 2018 Dec;55(12):9029-9042.