北京师范大学周凯翔团队在NIR-II有机荧光分子开发方面取得重要进展

北京师范大学周凯翔团队在NIR-II有机荧光分子开发方面取得重要进展

北京师范大学周凯翔团队在近红外二区（NIR-II）有机荧光分子开发方面取得重要进展。研究团队开发了一种新型小分子荧光染料DA-5，用于NIR-IIb窗口成像，并合成了两种荧光染料VIX-1250和VIX-1450，其中VIX-1450的发射波长达到1450 nm。这些研究成果为生物医学成像技术的发展提供了新的可能性。

大道至简：供体工程开发新型NIR-IIb窗口成像荧光分子

随着生物医学成像技术的不断发展，近红外（NIR）荧光成像因其高穿透深度和低组织自发光特性，成为生物医学研究中的重要工具。特别是近红外-II窗口（NIR-II，1000-1700 nm）的成像技术，因其更深的组织穿透能力和更高的成像分辨率，受到了广泛关注。NIR-II窗口进一步分为NIR-IIa（1000-1300 nm）和NIR-IIb（1500-1700 nm）两个子区域，其中NIR-IIb窗口由于水分子吸收的减少，提供了更高的成像清晰度。然而，现有的NIR-IIb荧光分子大多结构复杂、合成难度大，且在实际应用中存在光稳定性和化学稳定性不足的问题。小分子荧光染料因其结构可控、毒性低和代谢明确等优势成为研究热点，但传统对称型花菁染料因长共轭链易聚集、溶剂化淬灭等缺陷，难以满足NIR-IIb成像需求。因此，开发一种结构简单、稳定性高且适用于NIR-IIb窗口的小分子荧光染料成为了当前研究的重点。

通过分子设计策略，研究团队成功开发了一种新型小分子荧光染料DA-5。该染料基于经典的菁染料结构，通过减少聚甲川链的长度并打破对称性，形成了不对称的供体--受体（D--A）结构，显著增强了供体的电子给体能力，使其在1088 nm处发射荧光。DA-5不仅具有优异的光稳定性和化学稳定性，还能在水溶液中抵抗溶剂化效应引起的淬灭和聚集现象。此外，DA-5具有大的斯托克斯位移（241 nm）和高亮度（321 M-1 cm-1），使其在NIR-IIb窗口下的淋巴系统、肠道血管、全身血管造影以及脑部和后肢微血管成像中表现出色。

图1.（a）氰基框架是NIR-II小分子染料的关键候选物，其发射受聚甲川链长度的高度控制。（b）缩短聚甲川链使得分子具有了抗猝灭、抗聚集和稳定性。它的结构优势使有效的供体工程能够抵消由减少的分子共轭长度引起的蓝移。（c）供体工程细节和DAs探针的发射光谱。（d）分子轨道分析。（来源：J. Med. Chem）

传统花菁染料依赖长共轭链实现长波长发射，但易聚集和淬灭。研究团队基于菁染料的结构，通过缩短聚甲基链的长度并打破对称性，设计了一系列不对称的D--A结构分子（图1a）。研究团队将传统的菁染料的多甲川链缩短为单甲川链，损失了约300 nm的发射波长，但通过增强供体的电子给体能力，成功将发射波长推至1088 nm。研究团队通过选择具有强电子给体能力的供体（如julolidine）和强电子受体能力的受体（如HC1376），设计了一系列不对称的D--A结构染料。研究团队通过逐步增加供体的电子给体能力，设计了一系列供体，从苯基到萘基，再到含氮的六元环系统，最终选择了julolidine作为最强的供体。通过理论计算（如HOMO-LUMO能隙分析），验证了供体工程策略的有效性，表明随着供体给电子能力的增强，分子内的电荷转移（ICT）效应增强，发射波长逐渐红移。通过密度泛函理论（DFT）计算，优化了分子的基态几何结构，并分析了最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）的分布，进一步验证了供体工程对分子光学性质的影响。最终研究人员筛选出了具有优异光学性质的DA-5分子（图1b）。DA-5的分子结构简单，仅含有一个共轭双键，这使其在NIR-II窗口下的荧光发射波长达到了1088 nm（图1c），表现出优异的化学稳定性和光稳定性，且在极性溶剂中不易发生聚集和淬灭。理论计算进一步验证了DA-5分子中的电荷转移效应（图1d），表明其具有优异的荧光性能。

图2. 不对称DA染料的光物理性质。探针DA1-5（10 M）在二氯甲烷中的归一化吸收光谱（a）和发射光谱（b）。（c）相对量子产率计算。（d、f、h）DA-5（d）、IR26（f）和Flav7（h）在含有不同比例的乙腈/水混合物中的吸收光谱。（e，g，i）DA-5（e）、IR26（g）和Flav7（i）在二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜和水（磷脂胶束形成）中的吸收光谱。（j）ICG、IR26和DA-5对生物亲核试剂和活性氧的化学稳定性。（k）光稳定性。（来源：J. Med. Chem.）

研究人员对DA-5的光物理性质进行了详细研究。实验结果表明，DA-5在二氯甲烷中的量子产率为0.77%，接近已知的高亮度染料Flav7（图2c）。此外，DA-5在极性溶剂中表现出优异的抗淬灭性能，即使在水中也能保持较高的荧光强度，与传统染料IR26和Flav7相比，DA-5在极性溶剂（如水和乙腈）中吸收峰稳定，仅发生轻微蓝移（65 nm），强度保留66.3%（图2d-i）。DA-5还表现出优异的化学稳定性和光稳定性，能够在生物环境中长时间保持荧光强度（图2j-k）。

图3.（a）针对组织穿透深度的NIR荧光成像示意图。（b）不同窗口穿透深度。（c）信噪比分析。（d）淋巴系统的高分辨率成像。（e）淋巴管半峰宽分析。（f）在不同成像窗口下DA-5（100µL，5mg/kg）的肠系膜成像。（g）高斯拟合。（来源：J. Med. Chem.）

为了评估DA-5在生物组织中的穿透能力，研究人员使用1%的脂肪乳模拟生物组织，测量了DA-5在不同深度下的荧光信号（图3a）。实验结果表明，DA-5在1500 nm波长下的穿透深度达到了7 mm，且信号背景比（SBR）显著高于900 nm和1300 nm波长下的成像效果（图3b-c）。这一结果表明，DA-5在NIR-IIb窗口下具有优异的成像潜力。

研究人员将DA-5应用于小鼠的淋巴系统和肠道血管成像。实验结果显示，DA-5在1500 nm波长下的成像效果显著优于900 nm和1100 nm波长下的成像效果（图3d-f）。特别是在肠道血管成像中，DA-5能够清晰地显示出高密度的肠系膜血管和肠壁血管，而在较短波长下，这些血管几乎与背景信号融为一体（图3g）。

图4.（a）小鼠全身血流成像。（b）高斯拟合以及信噪比分析。（c）注射DA-5后在18秒、51秒、300秒等时间点的血流动态成像。（来源：J. Med. Chem.）

图5. 静脉注射后不同成像窗口下小鼠脑血管和后肢的NIR-II成像。（来源：J. Med. Chem.）

DA-5还被用于小鼠的全身血管造影和脑部微血管成像。实验结果表明，DA-5在1500 nm波长下的全身血管成像分辨率显著高于传统的NIR-I和NIR-IIa成像（图4a-b）。此外，DA-5在小鼠脑部微血管成像中也表现出色，能够清晰地显示出脑血管的细节，SBR值达6.1（图5a）。通过后肢微结构解析可知，NIR-IIb窗口可区分间距极近的血管（图5b），验证其在复杂微循环研究中的潜力。这些结果表明，DA-5在NIR-IIb窗口下的成像效果显著优于传统的近红外成像技术。

发射波长达1450 nm的D-A-D类染料

荧光成像能够通过非侵入性方式实现对分子活动等的可视化和定量分析，耗时较短且灵敏度高，在临床诊断和治疗中占有重要地位。与NIR I（约0.7-0.9μm）相比，NIR II（约0.9-1.7μm）在生物成像上展现出独特优势，生物自发光较弱、组织散射较少、组织穿透能力强、空间分辨率高，研发NIR-II荧光探针具有巨大的应用价值。

迄今为止，包括纳米材料和小分子有机物在内的一系列荧光团已被应用于NIR-II成像。其中，常见的强推拉电子结构有供体-受体-供体（D-A-D）、供体-π-受体（D-π-A）等。为了实现红移的吸收/发射特性和优异的体内成像能力，该课题组在已报道的染料 VIX-3（吸收波长 = 877 nm，发射波长 = 1070 nm）的基础上采用两种策略——增强供体能力和延长π共轭双键长度——扩展共轭系统，以诱导发射波长的红移，合成了两种荧光染料VIX-1250和VIX-1450，其吸收/发射波长显著红移，分别达到942/1250 nm和1098/1450 nm（图1a, c, d）。这与计算化学模拟结果相符合，从VIX-3到VIX-1450，LUMO-HOMO能隙逐渐减小，VIX-1450具有最强的ICT效应（图1b）。值得注意的是，VIX-1450的吸收最大值为进入NIR-II，在此窗口激发（1064 nm）下几乎没有自体荧光，将有利于体内成像。

随着波长增加，VIX-1450的荧光强度有所减弱（VIX-1250: 91 M−1 cm−1， VIX-1450: 13M−1 cm−1），但表现出更高的光稳定性和化学稳定性。以1% Intralipid为人工组织模型，发现相较于980 nm，VIX-1450在1064 nm激发波长下能达到更深的穿透深度。

*图1.（a）VIX-1250和VIX-1450的合成设计思路；（b）优化了VIXs的基态（S0）何形状、最高占据分子轨道和最低未占据分子轨道；（c，d）VIXs在CH2Cl2（10μm）中的吸收和荧光发射光谱.（来源：Anal. Chem.）*

血管成像对相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。综合上述，该课题组选择VIX-1450胶束进行全身血管、肠系膜和肠壁血管、脑部血管的荧光造影，并成功实现高清晰度的血管成像（图2），这得益于该染料较大的Strokes位移（352 nm）、较高的亮度及长波长特性。实验结果表明VIX-1450能够分辨较小的血管（毛细血管或小动脉），采用不同激发光源和长波通滤光片探究发现更长的激发/发射波长能够获得信噪比更高的图像，进一步验证染料VIX-1450的NIR-II吸收/发射和高稳定性的成像优势。

图2. 静脉注射后的实时血管成像。（a）1064 nm激发下Balb/c裸鼠全身血管成像的腹侧视图；（b）采用1064 nm激发结合不同长波通滤光片进行肠系膜血管和肠壁血管成像；（c）采用808 nm或1064 nm激光结合不同长波通滤光片进行脑部血管成像。沿相邻放大图中黄色箭头的横截面发光强度剖面（黑色）及其高斯拟合曲线（红色）。半定量的肠系膜、肠壁血管（d）和脑部成像（e）的信噪比（SNR）值。（来源：Anal. Chem.）

此外，VIX-1450与ICG结合进行双色成像，图3清晰地展示了不同通道之间的显著区别，成功几乎无串扰的双通道成像。因此，VIX-1450的长波长吸收/发射光谱可以与多种短波长染料偶合，使得不同器官的标记成为可能。

*图3.ICG和VIX-1450胶束的双色成像。（来源：Anal. Chem.）*