一文读懂蛋白质含量测定方法

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蛋白质含量测定是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品、药物、食品质量检测的重要指标。本文将介绍几种常见的蛋白质含量检测方法，包括紫外吸收法、凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法、考马斯亮蓝法、HPLC法和ELISA法。

紫外吸收法

检测原理：蛋白质分子中的芳香族氨基酸，包括色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸，含有可以吸收紫外光的共轭双键，在280nm波长处有最大吸收峰，且在此波长内吸光度与其浓度成线性关系。通过分光光度计检测目标蛋白280nm处的波长，即可根据Beer-Lambert定律（A=ECl；A代表吸光度，E代表消光系数，C代表蛋白质浓度，l代表光径长度，其中消光系数可以根据蛋白质序列估测）换算出目标蛋白的浓度。

图1：紫外分光光度法标准曲线

方法特点：

• 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
• 缺点：测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多。

干扰物：含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物质。

检出限：50~100ug蛋白含量。

适用范围：适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质

微量凯氏定氮法

凯氏定氮法被国内外视为蛋白质含量的标准检验方法，可作为衡量其他蛋白质含量检测方法准确性的标准。

实验原理：蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵；然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量算出含氮量，再将含氮量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。除另有规定外，氮转换为蛋白质的换算系数为6.25（蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16%左右，假设测定物质中的氮全来自蛋白质，则蛋白质含量=含氮量/16%=含氮量×6.25）。

图2：蒸馏装置

方法特点：

• 优点：通用性强，测定费用低，易实现，仪器简单且测定结果的重复性和重现性好。
• 缺点：实验耗时长、灵敏度低。

检出限：0.2~1mg蛋白含量。

适用范围：凯氏定氮法测的是总蛋白的量，一些非蛋白氮无法检测出。

双缩脲法

实验原理：
依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，在540nm处有最大的光吸收，且在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

图3：双缩尿反应络合物

方法特点：

• 优点：适合检测总蛋白质的含量，操作简单、测量速度快。
• 缺点：标准物质必须使用代表性很强的样品，需使用其他参考方法测出标准物质中的蛋白质总含量，故测定工作费力费时。不宜测定样品种类多、彼此差异大的样品。

检出限：测定蛋白质含量测定范围为1-20mg蛋白质。

干扰物：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

适用范围：常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

Lowry法

Lowry 法是双缩脲法的发展，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，是最灵敏的蛋白质测定方法之一，在生物化学领域得到广泛的应用，目前分为基本法和改良简易法，改良简易法可获得与基本法相近的结果。

基本法实验原理：本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物（第一步双缩脲反应），此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

特点：

• 优点：灵敏度高。
• 缺点：耗费时间长，操作时间需精准控制，标准曲线绘制麻烦，专一性较差，干扰物质比较多。

检出限：可检测的最低蛋白质量达5ug。通常测定范围是20~250ug。

干扰物：酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等。

适用范围：除蛋白含量测定，也可用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

考马斯亮蓝法

实验原理：
依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物（第一步双缩脲反应），此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

图4： 考马斯亮蓝G-250

方法特点：

• 优点：灵敏度比Lowry高约4倍，高效率、检测过程简便、只需要一种试剂，抗干扰能力强。
• 缺点：测定误差大，不适用于不同蛋白的检测。

检出限：其最低蛋白质检测量可达1ug。

干扰物：干扰物质少，但去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、0.1N的NaOH会干扰实验测定。

适用范围：可应用于医疗保健及食品行业的蛋白质测定。

HPLC法

原理：溶于流动相中的样品各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

仪器设备：高效液相色谱仪。

特点：具有定量准确、灵敏度高、重复性好、自动化程度高等特点，多用于成品的质量控制，且需要同种蛋白质做为标准品。

ELISA法

原理：特异蛋白含量测定方法，将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于微孔板内，加入待检样品，通过酶标物显色的深浅间接反映被检样品的存在与否或者量的多少。

仪器设备：酶标仪。

特点：该法特异性强、灵敏度高、可同时测定多个样品，适用于生产过程中目标蛋白质含量的测定。

蛋白质含量检测方法选择

蛋白质含量测定时，考虑以下因素后选定适用的检测方法。

• 实验对测定所要求的灵敏度和精确度
• 蛋白质的性质
• 溶液中存在的干扰物质
• 测定所要花费的时间