血清使用流程简介

血清使用流程简介

血清是生物医学研究中常用的细胞培养基成分，对细胞生长有广泛影响。本文将详细介绍血清的定义、储存和解冻方法、使用流程以及常见问题解答，帮助研究人员更好地掌握血清的使用技巧。

一、什么是血清

血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色透明液体；或指纤维蛋白原已被除去的血浆。

血清是⼀种纯天然培养基，含有细胞生长繁殖所需的多种营养成分，如蛋质、多肽等，多用于细胞培养、生物制品及诊断试剂的生产。且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。

二、如何正确的储存和解冻血清

1.血清的储存

未拆封的血清，⼀般情况下应存放于-20℃冰箱，在产品规定的效期内均可使用，若⼀次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至合适大小的无菌离心管内，再放回冷冻。

• 若存放于4℃，请勿超过1个⽉。
• 建议短期存储不要将血清储存在-80℃冰箱中。
• 如已储存在-80℃冰箱中，解冻时需要先放入-20℃冰箱至少24小时后再进行解冻，防止因为解冻时巨大的温差导致血清产生更多的沉淀。

2.血清的解冻

对于我们将要使用的血清，在解冻时⼀般都会选择最省心省力的解冻方式：放4℃过夜！但是直接在4℃冰箱里过夜融化的方法，虽然很多人在这么用，但还是有⼀些潜在的血险的。我们都知道，在血清这种混合物中，融化速度：蛋白质等干物质>水这类溶剂，所以蛋白质会率先溶解析出，而水还是结成冰的状态，导致瓶⼦中间会出现⼀根透明的冰柱，而周围则会呈现上黄下红的分层浑浊液的状态，在使用过程中很容易引起沉淀、混合不均匀、局部浓度过高等问题，影响细胞生长。

更重要的⼀点是，血清中珍贵的生长因子等活性物质，它们在解冻过程中，有着与细胞复苏类似的经历，都需要快速解冻才能最大程度地保留生物活性。显然，4℃过夜这样的长时间处理，很有可能会导致⼀部分「营养成分」的损失，影响细胞生长。

所以，为了更好地保留血清中的活性成分，使细胞培养更稳定，我们推荐使用三步法溶解，具体方法见下表。

注：在水浴过程中，血清要完全浸入水中，同时在融化过程中要慢慢摇动瓶身混匀血清，但在摇动中尽量不要产生泡沫。

三、血清使用流程

1.流程图

2.血清使用过程中的操作建议

• 在解冻过程中要慢慢摇动瓶身混匀血清。
• 血清分装前需混匀血清，以免造成分装后成分不⼀。
• 在分装过程中要保证全程在无菌环境中进行。
• 分装血清时每管血清需预留⼀定体积空间，防止因血清冷冻后体积膨胀导致发生污染或分装管冻裂。
• 根据自己的实验量决定分装量，最好能全部配成培养基，不要有剩余。
• 避免血清的反复冻融，尽量遵循现用现配、现配现解冻的原则。
• 若非必须，胎牛血清不需要热灭活处理。
• 若必须做血清的热灭活，请遵守56"C，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。
• 已解冻血清或已配好的完全培养基建议在4℃存放时间不超过7天。

四、常见问题

在细胞培养过程中，我们经常会遇到⼀些血清使用方面的问题或者⼀些困惑，下面我将例举几个在实验过程中的常见问题，帮助大家更好的进行细胞培养实验。

1.血清中絮状沉淀，它们是什么，怎么处理

血清制备过程中会保留部分纤维蛋白原，化冻过程中纤维蛋白原可转化为纤维蛋白，使血清中出现浑浊，絮状物。这种情况不影响血清的功效。

血清化冻过程中，在37℃水浴中放置时间过长，也会导致沉淀产生，沉淀物包含磷酸钙结晶。沉淀物也不影响血清功效。

若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加⼊培养基内⼀起过滤。我们不建议以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

2.如何避免血清中产生沉淀

我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作：

• 解冻血清时，请按照所建议的三步解冻法，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。
• 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均⼀，减少沉淀的发生。
• 请勿将血清置于37℃太久。若在37℃ 放置太久，血清会变得混浊，同血清中许多较不稳定的成分也会 因此受到损害，而影响血清的质量。
• 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。
• 若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30 分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

3.血清是否需要进行热灭活

何谓热灭活？

⼀般是以56°C，30分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有:溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

有必要做热灭活吗？

实验显示，经过正确处理的热灭活血赛，对⼤多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或者没有任何作用，甚⾄通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是“小黑点” ，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 环境中，⼜会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。因此我们建议，若非必须，可以不需要做热处理这⼀步。如此⼀来，不但会节省时间，更能确保血清的质量！

4.血清中的“黑胶虫”

在细胞培养的时候，有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动，小黑点有时呈点状，有时呈小的片状，运动形式为在原地振动，类似布朗运动，这种小黑点既不是细菌、霉菌，也不是支原体，目前业内人士称其为“黑胶虫”。黑胶虫究竟是⼀种生物还是非生物，本身就存在争议。

黑胶虫⼀般是存在血清里的，而血清通常是经过0.1μm滤膜过滤的，所以血清里不可能存在细菌、霉菌及支原体等微生物。如果说黑胶虫不是生物，它会不断增多，达到⼀定数量时会与细胞竞争性生长，与细胞竞争培养基中的营养，从而使得细胞营养不足而死亡。

支持黑胶虫是生物的理论:

根据国外相关资料，黑胶中是⼀类称为“纳米细菌"的微生物。纳米细菌是⼀种具有细胞壁的微生物。其体直径约为200纳米，是可于正常光学显微镜下成像的物件最小尺寸，大大低于细菌的理论下限。1996年，尚未发现纳米细菌时，这个大小被假定的理由是“现时所知⽣物需要用到的最小体型"。有关它们为生命体的报告是相当具冲击性的。假如这些微小的东西是生存着的，那么就意味着⼀种与细菌⼀点不同的崭新生命形式被发现。

支持黑胶中是非生物的理论:

反复冻融或灭活的血清，更加容易出现沉淀和黑胶虫，所以推测，所谓的“黑胶虫"其实就是血清中的某些蛋白成分和矿物质形成的晶体，在培养体系中，镜检见到的运动其实是这些物质在溶液中做“布朗运动"。随着细胞消耗培养基，这些物质析出的越来越多，最后细胞所用的营养消耗完，细胞容易死亡。

5.细胞培养是否必须加胎牛血清

血清是细胞培养基中重要的培养成份之⼀，对细胞生长有广泛影响。在细胞培养时，我们通常会加入5% - 20%之间的血清。血清的质量对细胞培养的成功至关重要。⼀般说来，牛血清包括以下成分：生长因子(如激素，白细胞介素等)，他们可以促进细胞生长；贴附因子，他们可以促进细胞的贴壁，往往只有细胞贴壁才能增值(悬浮培养的细胞除外)；蛋白质(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作为营养物质，又可以中止胰酶的作用；还有很多成分不明的物质。血清还可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性。血清还可以是细胞免受机械损伤。因此，无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，血清是常用的。除非因实验要求无血清培养时，例如：为使细胞同步化时，我们会采用无血清培养的。⼀般来说牛血清分为胎牛血清、新牛血清、小牛血清三类，而三者之间主要是根据采集的牛龄来进行区分。根据牛出生时间和血清采制分离方法分为：

• 胎牛血清: 取自出生2小时之内的新生牛心脏穿刺取血。
• 新生牛血清：24小时以内的新生牛静脉采血。
• 小牛血清：出生1-30天以内的小牛动脉采血分离血清。

某些细胞必需胎牛血清才能生长，如：干细胞、淋巴细胞、星状胶质细胞等；而有些细胞只需小牛血清即可，如肿瘤细胞等。