一种快速简单的质粒浓度纯度质控方法

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@小白创作中心

一种快速简单的质粒浓度纯度质控方法

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来源

https://www.ebiotrade.com/newsf/2024-11/20241118102519714.htm

质粒是基因工程中常见的运载体，其浓度和纯度的质控对于保证实验结果的准确性和安全性至关重要。本文介绍了一种基于紫外-可见光分光光度法的质粒浓度纯度质控方法，重点介绍了NanoDrop One超微量分光光度计在质粒制备过程中的应用。

质粒是闭合环状的双链DNA（dsDNA）分子，存在于许多细菌以及酵母菌等生物中。具有自主复制能力，是基因工程最常见的运载体。

在质粒制备时，需要进行纯度和浓度质控，以保证批次间的一致性、安全性和有效性。

紫外-可见光（UV-Vis）分光光度法是一种快速简便的质控方法，很容易在质粒制备流程中实现。

超螺旋DNA检测的挑战

图1. 超螺旋DNA（红色线）与天然DNA（蓝色线）的吸收光谱位移。

利用分光光度法检测DNA浓度是基于嘌呤和嘧啶含氮碱基中芳香环的吸光度。超螺旋 DNA 由于含氮碱基的堆积取向，容易发生吸收光谱位移，表现为吸光度的降低。根据比尔定律，DNA 浓度与吸光度成正比，因此报告的浓度也低于预期。

为克服超螺旋 DNA 的低色度效应，可通过加热、拓扑异构酶、限制性内切酶或 NaOH 处理来松弛 DNA。在下游测序或 PCR 中也需要松弛 DNA，使引物和酶能适当进入 DNA。如果使用酶法，DNA 必须从污染的蛋白质中纯化出来，分光光度法才能准确测量吸光度。

实验步骤

图2. 开发质粒并使用 NanoDrop One 分光光度计质控。A) 制备质粒载体，B) 大肠杆菌转化并筛选，C) 提取和定量质粒 DNA。

图2概述了质粒制备的三个主要步骤，过程中结合了Thermo™ NanoDrop™One/OneC超微量紫外-可见分光光度计。

步骤A
首先是步骤A，载体制备，设计用于基因治疗的质粒克隆载体需要几个要素：复制源、lacZ基因、一个或多个感兴趣的基因、及用于筛选的抗生素抗性基因。利用限制性内切酶切割载体产生粘性末端以进行目标分子和载体的特异性连接。随后进行凝胶电泳，纯化其中感兴趣的片段。之后用NanoDrop One 超微量分光光度计来进行浓度和纯度质控，以确保连接反应成功。

步骤B
其次是步骤B，先对大肠杆菌进行 42°C 热处理，此时大肠杆菌会产生热休克。然后将转化混合物铺在含有显色底物的抗生素琼脂平板上，筛选蓝白菌落。

步骤C
最后是步骤C，用白色菌落接种含抗生素的生长培养基，培养过夜。用 NanoDrop One 超微量分光光度计测定 600 nm处的光密度（OD₆₀₀）。从大肠杆菌细胞中提取质粒 DNA，并在下游应用之前用 NanoDrop One 仪器进行最后的纯度和浓度质控。

质粒制备时要求纯化后的质粒没有蛋白质污染，因为蛋白质可能会对患者产生副作用。传统方法中，A260/A280 纯度比可以衡量核酸中的蛋白污染。然而，由于大多数蛋白质的消光系数较小，因此需要较高比例的蛋白质（约 50%）才能明显影响核酸纯度比。Acclaro™ 智能污染物分析功能可以识别样本中的污染物，并扣除污染物得到真实样本浓度，即使是低浓度的污染物仪器也可以识别并扣除，从而克服了这一障碍。

实验结果

质粒DNA的OD₆₀₀值

*表 1 列出了所有三种样品和阴性对照的OD₆₀₀值，及其标准差。GeneJET 质粒中间产物制备试剂盒要求在 600 nm下的OD值为2 - 3。检测结果中所有样品均在此范围内，平均为2.5 - 3。除阴性对照外，所有样品的平均OD值是2.72。

2 - 3 的OD值不在大多数基于比色皿的分光光度计的检测范围内，但NanoDrop One 超微量分光光度计的自动调节路径长度功能可提供精确的OD值。默认的细胞转换系数为 1 x 10⁸ cells/mL，这是大多数细菌/细胞（如大肠杆菌）都适用的系数。利用比尔定律的这一系数，样品1 - 3的细胞密度分别为 2.70 x 10⁸、2.77 x 10⁸ 和 2.69 x 10⁸ cells/mL。

质粒DNA的浓度

*表 2 列出了三种纯化质粒 DNA 样品的浓度及其标准差。样品浓度范围为 6.73 ng/µL - 10.71 ng/µL，标准差小于 0.19 ng/µL，表明NanoDrop超微量分光光度计测量低浓度样品的重复性极佳。

超螺旋和松弛DNA的凝胶电泳结果

*图 3 是凝胶电泳结果的图像，证实了使用DNA旋转酶成功获取了超螺旋质粒DNA。超螺旋 pHOT1 在凝胶上的移动距离比松弛 pHOT1 要远，因为超螺旋拓扑结构使凝胶移动速度更快。

超螺旋、松弛和热处理的质粒DNA浓度

*表 3 列出了 pHOT1 的超螺旋、松弛和热处理的样品浓度。松弛pHOT1作为对照，平均浓度为 51.23 ng/μL。超螺旋 pHOT1 显示出吸收光谱位移，导致浓度降低为 14.10 ng/μL。对超螺旋 pHOT1 进行热处理后，其浓度恢复到 55.78 ng/μL。在热处理时，过高的温度会使 dsDNA 变性为单链，从而导致高色移和浓度增加。因此预先进行 DNA 熔化实验准确确定 dsDNA 变性为 ssDNA 的熔化温度非常重要。