什么是质粒拷贝数？如何降低和提高质粒拷贝数？
什么是质粒拷贝数？如何降低和提高质粒拷贝数？
质粒拷贝数是生物科学研究中的一个重要概念，它不仅影响质粒提取的产量，还关系到实验设计和结果的可靠性。本文将从质粒拷贝数的定义、重要性以及如何操纵质粒拷贝数三个方面，为大家提供全面而深入的解析。
拷贝数是什么意思？
质粒拷贝数是指每个宿主细胞的平均或预期拷贝数。质粒可分为低、中或高拷贝数。质粒的拷贝数差异很大，具体取决于三个主要因素：
- ori 及其成分（例如 ColE1 RNA I 和 RNA II）。
- 质粒及其相关插入片段的大小（较大的插入片段和质粒可能会以较低的数量复制，因为它们代表细胞的巨大代谢负担）。
- 培养条件（即影响宿主代谢负荷的因素）。
虽然根据拷贝数对质粒进行分类的方式存在差异，但也存在一个非常普遍的经验法则认为：低拷贝数是指每个细胞含有15-20个质粒拷贝；中等拷贝数是指每个细胞含有20-100个质粒拷贝；高拷贝数是指每个细胞含有500-700个质粒拷贝。
为什么知道质粒的拷贝数很重要？
在开始实验之前，了解质粒属于哪一类至关重要。如果使用的是低拷贝数质粒，那么不应该对低产量感到太惊讶，可能会决定培养更多的细菌。另一方面，如果高拷贝质粒的产量很差，则需要进行一些故障排除，前提是插入片段不是太大！高质粒拷贝数的一个优点是，当细胞分裂时发生随机分配（即，将质粒分配到子细胞中）时，质粒具有更大的稳定性。然而，大量质粒也会导致产量降低。
让我们看看在实验中真正需要考虑拷贝数的几种情况：
什么时候高拷贝数好？
在几种情况下，需要高拷贝数的质粒，包括：
蛋白表达。 尽管在蛋白质产量方面，使用高拷贝数质粒比基于 pBR322 的载体没有显著优势，但如果遇到蛋白质产量低的情况，高拷贝数质粒可能是首选选择。请记住，非常高的拷贝数会导致蛋白质聚集和翻译后修饰缺陷，这可能是因为代谢负担太高。
克隆。 使用高拷贝数质粒通常会提高质粒制备的产量。
什么时候低拷贝数是好的？
大家可能认为高拷贝数总是最好的，但有些情况更适合于低拷贝数。
表达有毒产物。 如果想研究一种真菌蛋白的抗菌特性，并且想在细菌中表达它。低拷贝数质粒可能更适合最大限度地减少毒性作用并避免杀死细菌培养物。
突变体研究。 例如已经改变了感兴趣的酶。现在想将其活性与生理背景下的野生型酶进行比较（即，将其转化为天然宿主细胞）。来自单个拷贝的低水平表达通常是增加生理相关测量机会和评估体内表型的更好选择。过表达的蛋白质可能会产生人工表型、错误的蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质本身的结构问题，从而导致令人困惑和不可靠的结果。（我们都知道，结果可能会足够混乱，而不会使事情进一步复杂化！
如何操纵质粒拷贝数？
由于上述原因，在进行研究时，可以选择具有不同拷贝数的质粒可能是有利的。人们已经付出了很多努力来了解如何控制质粒复制，为我们操纵这个质粒拷贝数铺平了道路。让我们看看我们可用的几个选项。
通过温度变化和改变细菌生长速率诱导扩增。 通过在高温下培养宿主可以增加某些质粒的拷贝数。pBR322 可能是这种情况，因为细菌生长速率会影响 RNA I/RNA II 调节的微调。
氯霉素扩增 氯霉素扩增适用于许多含有 pMB1 来源的低拷贝质粒。主要过程是：宿主细菌培养物暴露于抗生素氯霉素会抑制细菌蛋白质合成。这导致染色体复制抑制，因为这也依赖于正在进行的蛋白质合成和细胞分裂的抑制。质粒只需要更多长寿命的蛋白质，即使染色体复制和细胞分裂已经停止，也要继续复制。最终，当细胞耗尽（蛋白质耗尽）时，质粒复制停止，但平均拷贝数将显着增加。
意外中操作质粒拷贝数 如上所述，质粒插入片段也会影响拷贝数。例如，当连接到非常大的 DNA 插入片段时，高拷贝 pUC 质粒可能以中等或低拷贝数复制，从而导致质粒产量低于预期。产量降低是因为质粒复制是宿主细胞的代谢负担。如果负荷变得太大（例如，大量插入片段、生长温度升高），携带质粒的细胞将变得效率降低，并且生长会减慢。最终，培养物将由现有的无质粒细胞主导，导致质粒产量低。