详解CHO细胞中HCP的影响及去除策略

详解CHO细胞中HCP的影响及去除策略

CHO（中国仓鼠卵巢细胞）是目前治疗性蛋白药物生产的首选细胞株。然而，在表达目的蛋白时，CHO细胞会产生大量杂质，其中宿主细胞蛋白（HCP）是一类主要的相关杂质。即使含量很低，HCP也会对药物的安全性和有效性产生影响。

HCP是由多种蛋白质组成的混合物，等电点在4.5-7之间，不同蛋白对药品的影响各不相同。有一些蛋白水解酶类的HCP会引起重组蛋白的降解和聚集，从而影响产品质量[1]。另有一些HCP，如溶酶体磷脂酶A和磷脂酶B，会促进聚山梨酯20（PS20）和聚山梨酯80（PS80）的降解[2]。此外，在亲和层析中，HCP会导致淋洗过程中产生不同程度的浑浊，可能影响层析填料的清洗和寿命[3]。

因此，降低HCP是生物药品质量控制的重要环节，通常CHO表达生物制品的最终HCP含量需要控制在1-100 ppm。

在HCP控制中，常见的方法包括：控制上游培养细胞活率以降低HCP水平，优化层析工艺去除HCP，调节低pH及回调参数去除HCP，以及通过添加深层过滤参数去除HCP。本文将重点探讨深层过滤在HCP去除中的原理和应用。

深层过滤的组成及去除原理

深层过滤通常由纤维素、助滤剂和合成树脂组成。纤维素为滤膜提供了良好的多孔和渗水性基架结构；助滤剂与纤维基架结合，主要通过吸附特性辅助机械拦截机制对污染物起到拦截作用；合成树脂可以有效提高深层膜层的湿强度，且常含有季胺伯胺官能团，电位表现为正电性，可以通过静电吸附去除异种电荷的相关杂质。

深层膜较厚，通常为1.3-5 mm，内部流道迂回曲折，其截留作用可通过直接拦截和惯性撞击的机理高效去除颗粒物，达到澄清效果。在HCP去除中，深层过滤也展现出良好的效果。去除原理通常被认为是通过静电吸附（阴阳离子交换）、疏水作用、氢键和分子间相互作用力吸附料液中的HCP分子。

影响HCP去除效率的因素

滤器材质

不同滤器内部配比及合成树脂修饰不同，滤器的表面电位会有差别，因此所依赖的HCP去除原理也会有差别。

料液特性及缓冲液

深层滤器去除可溶性杂质HCP的主要吸附作用机理，如静电吸附和疏水作用吸附，都会受到料液中pH、离子类型和浓度的影响。例如，Negin等[4]研究发现，在30 mM和150 mM PBS两种buffer体系中，深层滤器对模型蛋白的吸附在更低的PBS浓度下更高。此外，不同pH值下，深层滤器、目的蛋白、HCP所带电荷也会不同，从而影响深层过滤的蛋白回收率和HCP去除效果。对于不同的料液及HCP去除要求，除了测试不同材质的深层滤器，还可以通过调整待过滤料液的pH和离子强度，以达到更好的回收率和HCP去除能力。

过滤参数

载量、滤速及连接方式都会对深层工艺中HCP的去除效率产生影响。随着载量的升高，深层滤器对HCP的吸附会逐渐趋于饱和，因此在工艺开发过程中，应注意不同载量下HCP的去除趋势，根据需求选择合适的载量。此外，深层滤器串联后去除HCP的效果大于并联的去除效果，这可能是由于料液在滤器中间和边缘滤速不同，串联使得更多料液有效接触过滤介质，从而产生了1+1>2的去除效果[3]。

深层过滤实验设计及操作

根据浊度选择合适滤器，调节pH（pH 5-5.5）和电导（电导控制在5 mS/cm以内），进行深层滤器水冲洗去除TOC和颗粒物（100 L/m²），buffer平衡（20-30 L/m²），上样（滤速120 LMH）并收集滤后料液（分段收集，每45 ml收集一次），顶洗，绘制载量和HCP去除效率关系，确定最终载量。

下图是Cytiva的PDE2深层滤器在HCP去除中的相关数据：

图1：抗体低pH后HCP去除效果

图2：重组疫苗（CHO细胞表达）亲和层析后HCP去除效果

总的来说，在下游工艺中，随着监管对HCP含量的控制要求越来越高，对于一些特殊料液，单纯依赖层析技术很难达到最终质量要求，而在中间品中适当添加深层工艺，反而会达到较好效果。

参考文献

1. S.X. Gao, Y. Zhang, K. Stansberry-Perkins, A. Buko, S. Bai, V. Nguyen, M.L. Brader, Fragmentation of a highly purified monoclonal antibody attributed to residual CHO cell protease activity, Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 977-982
2. N. Dixit, N. Salamat-Miller, P.A. Salinas, K.D. Taylor, S.K. Basu, Residual host cell protein promotes polysorbate 20 degradation in a sulfatase drug product leading to free fatty acid particles, J. Pharm. Sci. 105 (2016) 1657-1666
3. Yinges Yigzaw, Robert Piper, Minh Tran, and Abhinav A. Shukla. Exploitation of the Adsorptive Properties of Depth Filters for Host Cell Protein Removal during Monoclonal Antibody Purification. Journal of Chromatography A, 2014, 1357, 147-154.
4. Nejatishahidein N, Borujeni EE, Roush DJ, Zydney AL. Effectiveness of host cell protein removal using depth filtration with a filter containing diatomaceous earth. Biotechnological Progress. 2020 Nov;36(6):e3028.