手把手教学|细胞消化与传代
创作时间:
2025-03-17 06:49:17
作者:
@小白创作中心
手把手教学|细胞消化与传代
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1
来源
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细胞消化与传代是细胞培养过程中非常重要的环节,其目的是将已经生长到一定密度的细胞进行分离和转移,以便继续培养。常见的细胞消化方法有三种:机械消化法、离子螯合法和酶消化法。考虑到对细胞的损伤以及后续培养的效果,最常用的是胰酶消化法。悬浮细胞的传代相对简单,不需要用酶消化,这里主要介绍贴壁细胞系的酶消化法。
细胞消化
当细胞生长到密度接近80%时,需要进行消化传代。
- 弃去旧培养基,用预热好不含钙离子、镁离子的PBS润洗两次,以去除旧培养基对胰蛋白酶消化的抑制作用。
- 加入适量的胰蛋白酶,放入培养箱中消化。根据不同细胞种类的消化时间,在显微镜下观察到细胞形态变圆脱落、细胞间隙变大、瓶底呈现花斑状时,用两倍于胰蛋白酶的完全培养基终止消化。
细胞分离
细胞消化后,采用九宫格法吹落细胞收集到离心管,以800-1000rpm,室温离心5min。弃去胰蛋白酶,用完全培养基充分重悬细胞。
细胞计数
使用血细胞计数器或自动细胞计数仪对细胞悬液进行计数,计算传代所需的细胞数量;或根据经验按照比例传代。
细胞传代
将培养瓶中加入部分完全培养基,而后取适量单细胞悬液加入混匀。
细胞培养
接种好细胞后,应在培养瓶上标记上细胞名称、传代日期和操作人姓名等信息,轻轻摇匀后转移到37℃、5% CO2培养箱中培养,并定期观测细胞状态。
注意事项
- 细胞生长到覆盖70~80%瓶底时消化较好,若细胞密度过大则消化后细胞易成团。
- 在细胞消化时,应根据不同类型的细胞和不同实验目的选择适当的消化方法、消化液和消化时间。例如在使用流式细胞仪检测细胞凋亡等试验时,需要使用不含EDTA的弱消化液,以防止过度消化损伤细胞造成的细胞死亡影响实验结果。
- 比较难消化的细胞,可以分批次消化,减少过度吹打损伤细胞,避免先消化下来的细胞被过度消化。
- 比较容易消化的细胞可以选择浓度低的胰蛋白酶(一般采用的浓度为 0.1%-0.25%)或者用PBS稀释胰酶使用。
- 传代密度需要根据不同特点的细胞分别考虑,有些细胞有密度依赖,密度低导致的不增殖、细胞老化;同时也有密度高导致生长抑制或非单层生长导致不好消化的情况。
- 注意温度、pH、血清、钙、镁离子等因素对胰酶的抑制作用。
本文作者是"胡图图"同学,经授权后在公众号发布。
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