手把手教学｜细胞消化与传代

手把手教学｜细胞消化与传代

细胞消化与传代是细胞培养过程中非常重要的环节，其目的是将已经生长到一定密度的细胞进行分离和转移，以便继续培养。常见的细胞消化方法有三种：机械消化法、离子螯合法和酶消化法。考虑到对细胞的损伤以及后续培养的效果，最常用的是胰酶消化法。悬浮细胞的传代相对简单，不需要用酶消化，这里主要介绍贴壁细胞系的酶消化法。

细胞消化

当细胞生长到密度接近80%时，需要进行消化传代。

1. 弃去旧培养基，用预热好不含钙离子、镁离子的PBS润洗两次，以去除旧培养基对胰蛋白酶消化的抑制作用。
2. 加入适量的胰蛋白酶，放入培养箱中消化。根据不同细胞种类的消化时间，在显微镜下观察到细胞形态变圆脱落、细胞间隙变大、瓶底呈现花斑状时，用两倍于胰蛋白酶的完全培养基终止消化。

细胞分离

细胞消化后，采用九宫格法吹落细胞收集到离心管，以800-1000rpm，室温离心5min。弃去胰蛋白酶，用完全培养基充分重悬细胞。

细胞计数

使用血细胞计数器或自动细胞计数仪对细胞悬液进行计数，计算传代所需的细胞数量；或根据经验按照比例传代。

细胞传代

将培养瓶中加入部分完全培养基，而后取适量单细胞悬液加入混匀。

细胞培养

接种好细胞后，应在培养瓶上标记上细胞名称、传代日期和操作人姓名等信息，轻轻摇匀后转移到37℃、5% CO2培养箱中培养，并定期观测细胞状态。

注意事项

1. 细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若细胞密度过大则消化后细胞易成团。
2. 在细胞消化时，应根据不同类型的细胞和不同实验目的选择适当的消化方法、消化液和消化时间。例如在使用流式细胞仪检测细胞凋亡等试验时，需要使用不含EDTA的弱消化液，以防止过度消化损伤细胞造成的细胞死亡影响实验结果。
3. 比较难消化的细胞，可以分批次消化，减少过度吹打损伤细胞，避免先消化下来的细胞被过度消化。
4. 比较容易消化的细胞可以选择浓度低的胰蛋白酶（一般采用的浓度为 0.1%-0.25%）或者用PBS稀释胰酶使用。
5. 传代密度需要根据不同特点的细胞分别考虑，有些细胞有密度依赖，密度低导致的不增殖、细胞老化；同时也有密度高导致生长抑制或非单层生长导致不好消化的情况。
6. 注意温度、pH、血清、钙、镁离子等因素对胰酶的抑制作用。

本文作者是"胡图图"同学，经授权后在公众号发布。