科研干货 | 细菌浓度与数量计数方法！

科研干货 | 细菌浓度与数量计数方法！

菌体浓度是微生物学研究中的重要指标，准确测定菌体浓度对于实验结果的可靠性至关重要。本文将详细介绍几种主要的菌体浓度测定方法，包括直接计数法、活菌计数法、比浊法、测定重量法和颜色改变单位法，帮助研究人员选择最适合其实验需求的方法。

直接计数法

直接计数法是一种快速且简便的细菌数量测定方法，它允许我们直接通过显微镜观察细菌悬液中的细菌数量，并计算相应的浓度。

细菌计数板法

细菌计数板法是一种传统的直接计数方法，它使用一种特制的玻璃板，上面有精确的刻度和容积，用于容纳和计数细菌悬液中的细菌。这种方法的步骤如下：

• 制备细菌悬液：首先，需要将细菌样品制备成均匀的悬液。
• 样品放置：取一定体积的样品细菌悬液置于细菌计数板的计数池内。
• 显微镜观察：使用显微镜观察计数室内的细菌。
• 计数计算：根据计数室刻度内的细菌数，计算样品中的含菌数。

特点：

• 所需设备简单，测定结果较准确，可迅速得到结果。
• 在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征。
• 不能区分是否为细菌，不能区分活细菌和死细菌。

计算方法：

• 对于25×16的计数板，每毫升细菌数量的计算公式为：(100小格内的细胞数/100)×400×1000×稀释倍数
• 对于16×25的计数板，每毫升细菌数量的计算公式为：(80小格内的细胞数/80)×400×1000×稀释倍数

电子计数器计数法

电子计数器计数法是一种现代化的直接计数方法，其工作原理类似于血细胞分析仪。这种方法的步骤如下：

• 样品准备：制备细菌悬液，确保菌悬液中不含任何碎片。
• 电阻变化测定：电子计数器测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细菌。
• 脉冲记录：当一个细菌通过小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

特点：

• 测定结果较准确。
• 只能识别颗粒大小，不能区分是否为细菌，因此要求菌悬液中不含任何碎片。
• 计数单位：个/mL。

直接计数法，包括细菌计数板法和电子计数器计数法，是微生物学研究中常用的细菌浓度与数量测定方法。这些方法能够提供快速、准确的细菌计数结果，尽管它们在区分活菌和死菌方面存在局限性。在实际应用中，科研人员可以根据具体的实验需求和条件选择合适的计数方法。

活菌计数法

活菌计数法，也称为间接计数法，是一种基于活细菌在适宜的培养基和良好生长条件下能够形成菌落的原理。这种方法通过将待测样品进行一系列稀释，然后将稀释后的样品接种到培养基上，通过培养后形成的菌落来计数活菌数量。

稀释平板计数法

稀释平板计数法是活菌计数法中最常见的一种。其步骤如下：

• 样品稀释：将待测样品进行10倍系列稀释。
• 接种培养：取一定体积的稀释样品接种到无菌平皿中，倒入培养基并混匀。
• 培养观察：将平皿放入适宜温度的培养箱中培养，待菌落形成后进行计数。
• 计算活菌数：根据菌落数和稀释倍数计算原样品中的活菌数。

计算公式为：每毫升原菌液活菌数 = 同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数 × 稀释倍数 × 5。

薄膜过滤计数法

薄膜过滤计数法适用于样品中活菌浓度较低的情况。其步骤如下：

• 样品过滤：将待测样品通过微孔薄膜过滤浓缩。
• 培养计数：将滤膜放在适当的固体培养基上培养，长出菌落后即可计数。

此法可因操作不熟练造成污染，或因培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。尽管如此，由于该方法能测出样品中微量的菌数，仍是教学、科研和生产上常用的一种测定细菌数的有效方法。

PMA-qPCR技术

PMA-qPCR技术是一种结合了荧光染料和定量PCR的先进活菌计数方法。PMA（Propidium Monoazide）是一种能与DNA结合的染料，能够区分活细胞和死细胞。其步骤如下：

• PMA处理：将PMA加入样品中，活细胞不会被PMA标记，而死细胞的DNA会被PMA结合。
• DNA提取：提取样品中的DNA。
• qPCR检测：使用qPCR对提取的DNA进行定量分析，由于PMA与死细胞DNA的结合，只有活细胞的DNA会被检测。

PMA-qPCR技术在发酵食品活菌计数中的应用日益广泛，它能够提供快速、准确、特异的活菌计数结果。

MTT比色法

MTT比色法是一种基于活细胞内线粒体脱氢酶活性的活菌计数方法。其步骤如下：

• MTT加入：将MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）加入细菌悬液中。
• 还原反应：活细胞中的线粒体脱氢酶将MTT还原成蓝紫色的甲瓒。
• 吸光度测定：用酶标仪测定溶液的吸光度（OD值），从而确定活细胞数。

MTT法快速、经济、操作相对简便、重复性较好，近年来被广泛应用到多种微生物的活菌计数中。

比浊法

麦氏比浊法

麦氏比浊法是一种传统的比浊技术，由McFarland发明，用于微生物悬液的浊度标准比对。该方法基于不同比例的硫酸和氯化钡反应生成硫酸钡沉淀，形成不同浊度的标准浊度管。这些标准浊度管的配制比例是固定的，可以根据表格查到，从而得到不同浓度的浊度标准。

操作方法：

• 轻摇标准试管，使麦氏比浊管中的沉淀物均匀分散。
• 无菌操作将被测定的肉汤培养物加到与标准管相同直径的无菌试管中。
• 以无菌操作向被测定试管加入无菌生理盐水，直到浓度与所要求的标准管的浓度相同。

使用技巧：

• 直接用眼睛观察浊度，但这种方法需要经验，误差较大。
• 利用光在不同浓度液体折射不同的特点，可以在白纸上打上平行直线，然后观察浊度。

注意事项：

• 如果测定的肉汤培养物不澄清，需要通过减去未接种培养基的值来校正细菌浓度。
• 如果肉汤颜色很深，可以把未接种试管放在标准管的后面读数。

麦氏比浊法的优点在于简便快捷，适用于大量细菌悬浮液的快速测定，但对颜色太深的样品不适用。

光电比浊法

光电比浊法是一种基于光散射原理的现代比浊技术。当光束通过细菌悬液时，由于被散射或吸收而降低其透过量，细菌悬液的浓度在一定范围内与光密度成正比，与透光度成反比。这种方法可以使用分光光度计来实现。

基本原理：

• 细菌菌体是不透光的，光束通过细菌悬液时，由于被散射或被吸收而降低其透过量。
• 细菌悬液的浓度同光密度成正比，同透光度成反比，而光密度或透光度可以借光电池精确测出。

操作步骤：

• 制作标准曲线：先用血球计数板计数，再将菌悬液分别稀释调整为每毫升含不同的菌数，通过分光光度计分别测定其光密度（OD值），尽量控制光密度值在0.1—0.65之间，以得到较高精确度。
• 测定待测菌悬液的光密度值，根据标准曲线查得每毫升的细菌数。

光电比浊法的优点在于简便、迅速，可以节省许多稀释平板计数法的时间，便于在生产实践中控制细胞的数目。但颜色太深的样品或在样品中还含有其他物质的悬液，不能用此法测定。

测定重量法

重量法是测定细菌浓度的经典方法，它包括干重法和湿重法两种主要形式。这种方法适用于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的常用方法。

湿重法

湿重法是通过测量单位体积培养物经离心后湿菌体的重量来确定细菌浓度的方法。其步骤如下：

• 样品收集：取一定体积的细菌培养液。
• 离心：使用离心机将细菌从培养液中分离出来，通常离心速度和时间需要根据实验目的和细菌特性来确定。
• 称重：将离心后的湿菌体进行称重，记录其重量。
• 计算：根据菌体的湿重和培养液的体积，计算细菌的浓度。

湿重法的优点是操作简单，但结果可能受到培养液中其他悬浮颗粒的影响，因此需要对样品进行适当的预处理以减少误差。

干重法

干重法是通过测量单位体积培养物经离心后，将湿菌体烘干至恒重后失去水分的重量来确定细菌浓度的方法。其步骤如下：

• 样品收集：取一定体积的细菌培养液。
• 离心：使用离心机将细菌从培养液中分离出来。
• 烘干：将湿菌体置于干燥器中加热烘干，使之失去水分。
• 称重：待菌体完全干燥后，进行称重。
• 计算：根据菌体的干重和培养液的体积，计算细菌的浓度。

干重法的优点是结果较为准确，因为它排除了培养液中水分和其他可溶性物质的影响，但操作时间较长，需要等待菌体完全干燥。

颜色改变单位法

颜色改变单位法是一种基于微生物在培养基中的代谢活力来计数微生物数量的方法。这种方法特别适用于那些用传统比浊法无法计数的微生物，例如支原体。由于支原体的液体培养物是完全透明的，无法通过比浊法来计数，同时由于其固体培养困难，使用传统的cfu（菌落形成单位）法也难以计数，因此需要采用特殊的计数方法，即CCU法。

操作步骤

• 培养基准备：取12只无菌试管，每一管装1.8mL解脲脲原体培养基。
• 样品稀释：在第一管加入0.2mL待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2mL加入第二管，依次类推，进行10倍梯度稀释，一直到最末一管。
• 培养观察：将试管于37℃培养，观察培养基颜色的改变。以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力。例如，如果第六管出现颜色改变，则其相对浓度就是10的6次方CCU/mL。

特点

• 灵敏度：CCU法灵敏度高，适用于那些难以通过传统方法计数的微生物。
• 相对含量：CCU法计数的是微生物的相对含量，而不是绝对数量。
• 操作简便：该方法操作简单，但需要精确的操作技巧以避免污染。
• 适用性：特别适用于那些因体积小、透明或难以形成菌落而难以计数的微生物，如支原体。

应用

CCU法在微生物学研究中有着广泛的应用，尤其是在那些需要精确测定微生物代谢活力的场合。例如，在环境监测、工业发酵和临床诊断等领域，CCU法提供了一种有效的微生物数量测定手段。